風疹病毒包膜糖蛋白細胞融合活性位點的定位及衣殼蛋白對融合活性的影響.pdf

1、風疹病毒（rubella virus，RV）是披膜病毒科風疹病毒屬的唯一成員，人類是RV的唯一自然宿主。RV自然感染僅引起輕微的臨床癥狀，許多感染是無癥狀的亞臨床感染。一般于感染后16～20天內(nèi)出現(xiàn)皮疹，首先于面部出現(xiàn)，然后擴散到軀干及四肢，其余癥狀還包括低熱、淋巴結(jié)腫大和咽痛。RV感染的并發(fā)癥以關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)痛最為常見，而且多發(fā)生于婦女。 RV引起的主要問題是它的致畸性，即母親孕期感染RV會導致胎兒發(fā)生先天性風疹綜合征（con

2、genital rubella syndrome，CRS）。CRS的臨床表現(xiàn)多種多樣，其中耳聾最為常見，還包括心臟疾病、精神發(fā)育遲滯和眼部疾患如白內(nèi)障和青光眼。妊娠期間母親感染RV越早，胎兒損害越嚴重。 成熟的RV病毒顆粒是直徑為60nm的球形，核心是衣殼蛋白和單股正鏈基因組40S RNA組成的核衣殼，其外包繞脂質(zhì)雙層膜，膜上是長度為5～6nm的刺突--由糖蛋白E2和E1組成。衣殼蛋白（capsid protein，CP）是非糖

3、基化的磷酸蛋白，靠二硫鍵形成同源二聚體。CP富含脯氨酸和精氨酸，與RV基因組RNA的結(jié)合有關(guān)。 包膜糖蛋白E1和E2都是Ⅰ型膜糖蛋白，在病毒表面以異二聚體的形式存在。E1和E2都含有一段跨膜區(qū)（TM），長度分別為22和39個氨基酸。在E2中，TM之后是一段帶正電荷的七氨基酸序列和E1的20個氨基酸信號肽。E1和E2都富含半胱氨酸殘基，E1胞外功能區(qū)的20個半胱氨酸都形成二硫鍵，E2總共含有14個半胱氨酸殘基。E1有3個N-聯(lián)糖基

4、化位點，E2的N-聯(lián)糖基化位點數(shù)目在不同的毒株間有差別，除N-聯(lián)糖基化位點外，E2還含有O-聯(lián)糖基化位點。 E1和E2的功能研究較為廣泛，單克隆抗體研究發(fā)現(xiàn)E1至少含有6個不重復的抗原位點，與血凝和中和活性有關(guān)。E1還與病毒和細胞的吸附有關(guān)，是主要的表面蛋白。E2的功能研究顯得較為困難，因為它與E1結(jié)合后，幾乎不暴露在細胞表面，也就無法用單克隆抗體識別其抗原位點。但是，E2也含有部分血凝表位和中和表位，還有株特異性表位。

5、 細胞融合是包括RV在內(nèi)的許多有膜病毒侵入細胞、復制、釋放、傳播、致病的重要生物過程，也是細胞間信息傳遞的重要步驟。RV入侵細胞的途徑還沒有弄清楚，但是有證據(jù)表明是通過內(nèi)吞途徑進入細胞。Katow和Sugiura發(fā)現(xiàn)pH在6．0以下時，E1和E2會發(fā)生構(gòu)象改變，這種改變有利于病毒包膜與內(nèi)含體膜的融合。 若能弄清RV引起細胞融合的機制，從而改變RV的基因組，改變它的表達產(chǎn)物和生物學活性，就可以消除或降低RV的致畸性；也可以通過改

6、變其侵入細胞或復制的特性來消除或減少胎兒感染的危險性；還可以為研制更安全有效的RV新型基因工程疫苗（基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等）和特異性抗病毒的多肽類藥物奠定基礎。 細胞融合由位于細胞表面的蛋白引起，因此細胞融合功能的檢測需要所研究的蛋白能夠在細胞表面表達。RV E2的信號肽在病毒結(jié)構(gòu)蛋白的加工及轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，為了使所表達蛋白能夠在細胞內(nèi)正確加工及順利轉(zhuǎn)運至細胞表面，本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBSK-SPE2E1，即將

7、E2的信號肽序列、E2和E1的全基因序列克隆到載體pBluescriptⅡ SK+的EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點之間。然后利用定點突變和同源重組的方法，構(gòu)建一系列突變體，Giemsa染色和指示基因法檢測它們的細胞融合活性變化，流式細胞術(shù)（FACS）檢測蛋白在細胞表面表達效率，Western blot檢測總表達量的改變，血吸附實驗檢測受體識別活性，分析突變位點對RV包膜糖蛋白細胞融合活性的影響，以確定具有細胞融合活性的位點。本研究還構(gòu)建了

8、RV CP的重組載體pBSK-C，并檢測CP對包膜糖蛋白細胞融合活性的影響。 一、E1胞外功能區(qū)二硫鍵對RV細胞融合活性的影響 RV E1包膜糖蛋白胞外功能區(qū)含有20個半胱氨酸殘基，而且都形成分子內(nèi)二硫鍵。本研究利用定點突變和同源重組相結(jié)合的方法，將RV JR23株E1蛋白胞外功能區(qū)的20個半胱氨酸中的11個突變?yōu)槠渌被幔瑯?gòu)建了11個突變體Cys2、Cys3、Cys4、Cys5、Cys6、Cys8、Cys9、Cys

9、12、Cys13、Cys17和Cys20，每個突變體去除E1的1個二硫鍵，檢測單個二硫鍵的消失對E1細胞融合活性的影響。 二、E2中半胱氨酸對RV細胞融合活性的影響 RV包膜糖蛋白E2中含有14個半胱氨酸，其中12個位于胞外功能區(qū)，1個位于跨膜區(qū)，1個位于胞質(zhì)區(qū)。本研究利用定點突變和體內(nèi)同源重組的方法，用突變的寡核苷酸為引物，構(gòu)建了14個E2的半胱氨酸突變體，每個突變體去除一個半胱氨酸，這些突變體分別為C69T、C82S

10、、C91S、C124G、C132A、C139P、C152G、C157R、C172A、C196G、C207G、C219T、C255W和C259G。 三、E1關(guān)鍵氨基酸突變體對細胞融合活性的影響 E1胞外功能區(qū)的半胱氨酸突變分析顯示，第3、4和13位半胱氨酸突變之后，在細胞表面表達量與野毒株相比沒有降低，但是卻檢測不到融合活性，這3個半胱氨酸所形成的二硫鍵集中在E1的213～285位氨基酸之間，而這一段區(qū)域富含RV中和表位和

11、血凝抑制表位，具有較重要的生物學活性，我們在此區(qū)域選擇了一些保守的或結(jié)構(gòu)上比較特殊的氨基酸，構(gòu)建了12個突變體H226Q、H238Q、R252S、P253T、R254Q、R256T、L257T、D259G、D261G、P263A、R266Q和P269S。 四、衣殼蛋白CP對RV包膜糖蛋白細胞融合活性的影響 RV衣殼蛋白CP在病毒復制、組裝及感染過程中都有作用，本研究檢測其對包膜糖蛋白的細胞融合活性的影響。RV JR23株

12、感染BHK21細胞6天后提取病毒RNA，利用上游引物C1和下游引物C2反轉(zhuǎn)錄擴增C基因，引物中分別含有EcoRⅠ和SacⅠ酶切位點，擴增的片斷酶切后，與經(jīng)相同酶切的載體pBluescriptⅡ SK+片斷連接，測序證實成功構(gòu)建重組載體pBSK-C。將pBSK-C單獨轉(zhuǎn)染至BHK21細胞中，間接免疫熒光（IFA）檢測表達蛋白活性，結(jié)果在核周區(qū)可見到較強的熒光。將pBSK-C與RV糖蛋白重組質(zhì)粒pBSK-SPE2E1共同轉(zhuǎn)染BHK21細胞，

13、Giemsa染色發(fā)現(xiàn)細胞幾乎全部發(fā)生融合，與單獨轉(zhuǎn)染pBSK-SPE2E1的細胞相比，細胞融合灶數(shù)量增多而且每個融合灶的細胞核數(shù)量增加，用指示基因法定量細胞融合顯示共轉(zhuǎn)染引起的細胞融合為糖蛋白單獨轉(zhuǎn)染的137％?？梢奀P可以促進RV包膜糖蛋白的細胞融合活性。 從本實驗結(jié)果可得出結(jié)論： RV包膜糖蛋白E1胞外功能區(qū)的10個二硫鍵都是維持E1細胞融合活性不可缺少的，其中C（5）-C（8）影響E1和E2的相互作用。

14、 RV包膜糖蛋白E2序列中的14個半胱氨酸中，胞外區(qū)有1個半胱氨酸及胞質(zhì)區(qū)的唯一1個半胱氨酸對E1的細胞融合活性沒有影響，其余12個都對E1的細胞融合功能有重要作用，它們可能通過二硫鍵的形成間接對其產(chǎn)生影響。 RV E1的213～285aa，區(qū)域含有一些重要的細胞融合活性位點，是維持RV融合活性的關(guān)鍵氨基酸，如H238、P253、L257、D259G、D261、R266和P269。 成功構(gòu)建了RV CP的重組載體，并在