抗肺癌中藥單體的篩選及水飛薊素抑癌機制研究.pdf

1、肺癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。在我國數個大中城市中，肺癌的發(fā)病率、死亡率均已占男性惡性腫瘤的首位，女性惡性腫瘤的第二位。盡管手術、聯合化療及放療在肺癌的治療中起到了積極的作用，但因缺乏有效的早期診斷方法，70-80％的患者在確診時已失去早期根治性切除的時機。手術及放化療復發(fā)率高、易出現耐藥，故患者的5年生存率長期停留在20-30％左右。
　　中國傳統醫(yī)藥在腫瘤的治療方面有其獨特的理論。中醫(yī)藥治療

2、肺癌的有關資料表明：中醫(yī)藥不僅可以延長肺癌患者的生存期，而且能提高他們的生存質量。中藥配合放療、化療比單純使用放療、化療的療效更好。中藥既可增加化療藥及放射線的敏感性、又有放射防護作用，可減輕化療放療的副作用，起到抑瘤增效作用或放射增敏作用。
　　天然中藥以其療效廣泛、確切、毒性低，受到國內外廣泛的關注。本課題我們取多種中藥提取物或單體，通過體外實驗，篩選出能夠以較低濃度（微克/毫升水平）抑制肺癌生長或增殖的藥物。根據上述實驗結果

3、，選擇作用效果最明顯的中藥提取物或單體，研究其抑制肺癌細胞生長或增殖與相關信號轉導通路的關系，以及對肺癌細胞化療敏感性的影響。這些研究將為治療肺癌新型藥物的研制開發(fā)提供新思路，為我國傳統中醫(yī)藥進一步用于腫瘤的治療提供實驗依據?；诖?，本課題從以下四個方面進行了研究。
　　1、抗肺癌中藥單體的篩選：我們通過光學顯微鏡初步篩選了25種中藥單體或粗提產物中能有效抑制肺癌細胞增殖的藥物，發(fā)現可能有抑制腫瘤作用的(鏡下觀察有明顯細胞形態(tài)改變

4、的，如細胞皺縮，破碎，漂浮等)有12種，姜黃素、水飛薊素、大黃素、茶多酚、松多酚、大豆異黃酮、葛根異黃酮、染料木素、生姜提取物、鬼臼素、貫葉連翹提取物、桫欏子提取物等。在此基礎上，針對其中4種純度較高（＞80％）且抑制腫瘤細胞增殖明顯的藥物，姜黃素、大黃素、水飛薊素、大豆異黃酮，進一步采用MTT試驗驗證其對肺癌細胞系的抑制效果，結果顯示：SM對幾種細胞均有較強的抑制作用；大黃素對Anip973和A549細胞有作用，但對NCI-H292和

5、PLA-801細胞作用較弱；姜黃素對A549和NCI-H292細胞有作用，但對Anip973和PLA-801細胞作用較弱；大豆異黃酮對Anip973和PLA-801細胞有作用，但對A549和NCI-H292細胞作用較弱。這些結果表明藥物對于不同的細胞作用并不完全一樣，造成這一現象的機理有待于更深入的研究。
　　2、水飛薊素誘導高轉移表型肺癌細胞系（Anip973）細胞凋亡的分子機制研究：本實驗以肺癌細胞系Anip973細胞為研究對

6、象，探討分別給予不同劑量和不同時間點的水飛薊素處理后的肺癌細胞的凋亡情況，通過形態(tài)學及流式細胞儀我們觀察到水飛薊素可誘導肺癌細胞系Anip973細胞產生凋亡，且具有時間和濃度依賴性。在凋亡發(fā)生過程中，半胱天冬酶(caspase)家族和Bcl-2家族發(fā)揮重要作用。進而通過免疫印記法檢測發(fā)現SM作用于人高轉移肺癌細胞系Anip973細胞后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低，而凋亡蛋白Bax的表達明顯增加，說明水飛薊素的促凋亡機制與降低Bcl

7、-2/Bax的比例有關。
　　3、水飛薊素通過MAPK信號轉導通路逆轉A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性：我們通過MTT法檢測到水飛薊素可以逆轉肺癌A549/DDP細胞的耐藥性，并呈時間依賴性；流式細胞儀分析結果提示水飛薊素和順鉑聯用可以引起A549/DDP細胞凋亡或死亡，并呈時間依賴性。為了進一步探討水飛薊素誘導A549/DDP細胞凋亡的機制，我們采用Westernblot方法，應用針對MAPK家族成員JNK、ERK、p38磷酸

8、化形式及非磷酸化形式的特異性抗體，檢測了SM作用后以上激酶的表達水平及活化程度的改變。在不同濃度藥物作用24hr后，這幾種激酶的表達水平都沒有明顯的改變，而它們磷酸化的程度與加入DMSO的陰性對照組相比則有顯著的改變。其中ERK的磷酸化受到明顯的抑制，而JNK、p38MAPK的磷酸化水平有一定的增加。
　　4、水飛薊素對肺癌細胞Anip973裸鼠體內成瘤、增殖、凋亡以及血管形成的影響：本研究將Anip973細胞接種于裸鼠背部皮下，

9、建立人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型。建立模型后，給其腹腔注射SM結果顯示，與未處理組的裸鼠相比，注射水飛薊素的裸鼠腫瘤形成時間延遲，腫瘤生長緩慢，腫瘤體積及瘤重均明顯減小。各組腫瘤標本HE染色結果顯示，腫瘤細胞異形性明顯，細胞大小不一，形狀各異，瘤細胞生長致密。未處理組腫瘤標本凋亡細胞少見，而水飛薊素組腫瘤標本提示凋亡細胞增多，凋亡細胞表現為細胞變圓、固縮、胞膜出泡、染色質濃集、核深染。
　　綜上所述，我們認為水飛薊素具有通過調節(jié)半胱天