1,25-二羥維生素D3調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)以抑制腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化.pdf

1、目的：
　　巨噬細(xì)胞浸潤是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)對糖尿病腎病的發(fā)展具有重要作用。巨噬細(xì)胞可以分化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1)和非經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M2)兩種活化表型。調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)是干預(yù)糖尿病腎病進(jìn)展的潛在有效手段。糖尿病腎病的另一重要病理特征是腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)。近期發(fā)現(xiàn)，1，25-二羥維生素D3對糖尿病腎病有顯著腎保護(hù)作用。我們通過體外研究首次探討高糖對巨噬細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用，以及

2、這種作用對腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響，并進(jìn)一步探索1，25-二羥維生素D3對巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)調(diào)節(jié)作用機(jī)制以及對EMT的抑制作用。
　　方法：
　　第一部分：采用高糖(右旋葡萄糖)濃度依賴性(20mM，30mM，35mM)以及時間依賴性(0h，6h，12h，24h，48h)刺激人巨噬細(xì)胞系(U937)。檢測巨噬細(xì)胞活化表型標(biāo)志物：酶活性法檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)(M1標(biāo)志物)表達(dá)。RT-PCR法檢測iNOSmR

3、NA以及甘露糖受體(MRC，M2標(biāo)志物)mRNA表達(dá)；ELISA法檢測上清液中炎性細(xì)胞因子TNF-a、IL-12、IL-6(M1標(biāo)志物)。
　　第二部分：高糖(30mM，12h)刺激U937，分離上述細(xì)胞后與人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)共培養(yǎng)24h。觀察HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，運(yùn)用RT-PCR及Western blot方法檢測Fibronectin、a-SMA、E-Cadherin(EMT標(biāo)志物)表達(dá)。
　　第三部分：1，2

4、5-二羥維生素D3(10nM)干預(yù)高糖(30mM，12h)預(yù)孵育U937。檢測巨噬細(xì)胞活化表型標(biāo)志物：免疫熒光法檢測U937內(nèi)Fibronectin(M2標(biāo)志物)；RT-PCR檢測iNOS和甘露糖受體(MRC)mRNA，ELISA法檢測TNF-a、IL-12、IL-6。
　　第四部分：1，25-二羥維生素D3刺激高糖預(yù)孵育的小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)。RT-PCR法檢測iNOS(M1標(biāo)志物)、MRC、IL-10、Argin

5、ase mRNA(M2標(biāo)志物)；RT-PCR法檢測VDR、PPARγ mRNA。
　　第五部分：1，25-二羥維生素D3干預(yù)高糖(30mM，12h)預(yù)孵育U937后，與HK-2共培養(yǎng)24h。觀察HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，運(yùn)用RT-PCR及Western blot法檢測Fibronectin、a-SMA、E-Cadherin。
　　結(jié)果：
　　第一部分：高糖濃度依賴性刺激U937，各組中U937表達(dá)iNOS活性均增強(qiáng)(P<

6、0.05)，iNOS活性呈濃度依賴性上升。其中，30mM高糖組刺激U937表達(dá)iNOS活性達(dá)最大值(48±6.6 U/mgprot，P<0.01)。高糖時間依賴性刺激U937，高糖組從0至12h產(chǎn)生iNOS活性隨時間延長表達(dá)逐漸增加，呈時間依賴性(P<0.05)。高糖刺激U937達(dá)12h時iNOS活性達(dá)最大值(2.2±0.13倍vs對照組，44.6±10.7 U/mgprot)。在12h后，高糖組產(chǎn)生iNOS活性急劇下降，高糖組在24h

7、至48h間產(chǎn)生的iNOS活性與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。iNOS活性在高糖組與IFNγ/LPS組(M1模型組)中，各個時間點(diǎn)間變化(0h至48h)均無明顯差異(P>0.05)。高糖(30mM，12h)刺激iNOS mRNA表達(dá)增加(5.10E-05±1E-05，P<0.05)；MRC mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。高糖(30mM，12h)刺激U937分泌IL-6、TNF-a、IL-12顯著增加(645±57 pg/ml，

8、P<0.05；495±25 pg/ml，P<0.05；481±63 pg/ml，P<0.05)。
　　第二部分：高糖干預(yù)U937細(xì)胞12h，分離U937后與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，HK-2細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣外觀，細(xì)胞拉長、肥大，由橢圓形貼壁生長變?yōu)殚L梭形，喪失鵝卵石樣特征性形態(tài)。HK-2細(xì)胞表達(dá)Fibronectin、a-SMA蛋白水平增加(0.86±0.05，P<0.05；0.76±0.04，P<0.05

9、)，同時Fibronectin及a-SMA mRNA表達(dá)亦顯著增加(3.3E-02±3.5E-03，P<0.05；2.6E-05+2.1E-06，P<0.05)，E-Cadherin蛋白及mRNA表達(dá)降低(0.71±0.01，P<0.05；2.95E-04±1.14E-05，P<0.05)。
　　第三部分：1，25-二羥維生素D3(10nM)刺激高糖(30mM，12h)預(yù)孵育U937細(xì)胞48h。細(xì)胞內(nèi)Fibronectin(紅色熒

10、光)表達(dá)增強(qiáng)；細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，甘露糖受體(MRC)mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；炎性細(xì)胞因子TNF-a、IL-6、IL-12表達(dá)下降(368±40 pg/ml，P<0.05；489±48 pg/ml，P<0.05；199±11 pg/ml，P<0.05)。
　　第四部分：1，25-二羥維生素D3(10nM)干預(yù)高糖(30mM，12h)預(yù)孵育小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)48h，MRC、IL

11、-10、Arginase mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，而iNOS mRNA表達(dá)下降(P<0.05)；1，25-二羥維生素D3濃度依賴性(1nM，10nM，100nM，1000nM)干預(yù)高糖(30mM，12h)預(yù)孵育RAW264.7細(xì)胞，各組VDR mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)，呈濃度依賴性上升，1000nM1，25-二羥維生素D3刺激RAW264.7細(xì)胞表達(dá)VDR mRNA達(dá)最大值(70.6±7.5倍vs對照組)。而各組(1

12、0nM，100nM，1000nM)中PPARγ mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)，100nM1，25-二羥維生素D3刺激RAW264.7細(xì)胞表達(dá)PPARγmRNA達(dá)最大值(6.45±0.21倍vs對照組)。
　　第五部分：1，25-二羥維生素D3刺激高糖(30mM，12h)預(yù)孵育U937細(xì)胞48h后，分離提純上述細(xì)胞與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)24h。HK-2細(xì)胞恢復(fù)鵝卵石樣形態(tài)，僅少數(shù)發(fā)生形態(tài)變化。HK-2細(xì)胞表達(dá)Fibronecti

13、n及a-SMA蛋白下降(0.25±0.02，P<0.01；0.26±0.04，P<0.05)，E-Cadherin蛋白表達(dá)增加(0.77±0.05，P<0.05)；HK-2細(xì)胞表達(dá)a-SMA和Fibronectin mRNA(7.42E-04±4.9E-05，P<0.05；1.60E-01±0.01，P<0.05)下降，表達(dá)E-cadherin mRNA(3.85E-03±3.6E-04，P<0.05)上調(diào)。
　　結(jié)論：