遺傳性智障脆性X綜合征發(fā)病分子機制研究.pdf

1、脆性X綜合征(Fragile X syndrome，F(xiàn)XS)是常見的遺傳性智力低下疾病之一。臨床表現(xiàn)多樣，主要表現(xiàn)為中到重度的智力低下，常伴有巨睪、特殊面容、多動癥、癲癇發(fā)作，大量患者腦電圖存在特征性彌漫性瞬間慢波發(fā)放等臨床病理表現(xiàn)。超過99％的FXS是由位于Xq27.3的脆性X智力低下基因1(fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MRl)5'端非編碼區(qū)(CGG)<,n>三核苷酸重復序列的異常擴增及CpG島的異

2、常甲基化引起FMRl編碼產物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)的表達下降或缺失所導致。 分別定位于3q28及17p13.1的脆性x相關基因1/2(fragile X related gene 1/2，F(xiàn)XR1/2)被發(fā)現(xiàn)與FMR1具有高度的序列及結構相似性，且可兩兩以同源或異源二聚體形式存在，三者統(tǒng)稱為脆性X基因家族。FXR1/2類似于FMRl也具有與蛋白質結

3、合的功能及與mRNA結合的功能，而且本身也可以與FMRl mRNA、FMRP相互作用，可能與FXS的發(fā)病密切相關。 目前的研究提示，脆性X綜合征的發(fā)病與FMR1、FXRl/2三個基因相關，且三者存在相互作用，故本論文圍繞FMR1、FXR1這兩個基因(FXR2目前僅構建了基因載體)分四個部分開展了FXS發(fā)病分子機制的研究。首先，對于FMR1基因，主要應用酵母三雜交技術從表達調控的角度在蛋白質表達文庫中篩選FMR1 mRNA 3'-

4、非翻譯區(qū)的調控蛋白，并且通過建立高效快速的診斷方法，研究不同種族此基因結構的差異；對于FXR1基因，則通過應用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選并經免疫共沉淀驗證FXR1P的相互作用蛋白；最后應用酵母三雜交系統(tǒng)在RNA表達文庫中篩選能與FXR1P相互作用的mRNA，以期能找到一些從基因表達異常到臨床發(fā)病的相關環(huán)節(jié)或網絡關系，初步構建蛋白質.蛋白質、蛋白質-mRNA相互作用網絡調控圖譜，為揭示FXR1P的功能及其與脆性X綜合征的發(fā)病機制的關系提供新的線索

5、。 四部分研究內容、意義及結果如下： FMRl基因5'-非翻譯區(qū)(CGG)<,n>重復數(shù)目是臨床上診斷FXS的重要標準，建立一種(CGG)<,n>重復數(shù)目的確定方法對FXS的高效快速篩查和產前診斷具有重要意義，研究中國不同種族(CGG)<,n>重復序列的多態(tài)性可助進一步闡明FMR1基因的遺傳特征，針對FMR1的5'端GC堿基高度富集，DNA雙鏈較難解鏈，本研究采用了耐高溫酶及堿基替代法、PCR增效劑的添加及提高退火溫度，

6、改善擴增條件，對FMRl基因中GC含量較高的重復序列進行擴增，分別對漢族與壯族人群FXS遺傳性標記序列的多態(tài)性進行研究，建立了一種穩(wěn)定快速、適合大規(guī)模正常人群檢測(CGG)<,n>重復數(shù)及研究其多態(tài)性的方法。發(fā)現(xiàn)漢族人群和壯族人群X染色體(CGG)<,n>重復數(shù)最大值分別為28及29。 FMR1基因在翻譯水平上的表達調控異?？赡軐е翭XS患者FMR1的表達水平下降，因此篩選FMR1基因的mRNA3'UTR相互結合蛋白的工作對于闡明FXS

7、發(fā)病機理也具有探索性的意義。本研究構建了酵母三雜交系統(tǒng)pRH3/FMR1 mRNA 3'UTR的Bait質粒，轉染酵母菌株L40-ura3/pHtybLex/Zeo-MS2，共轉化法從人腦海馬回pYESTrp3-cDNA文庫中篩選了FMR1 mRNA 3'UTR的作用蛋白，將獲得的陽性質粒與誘餌質粒重新轉入酵母菌內，對RNA-蛋白質作用進行一對一驗證，對驗證后的陽性克隆的外源性片斷進行測序及同源性分析，發(fā)現(xiàn)了兩種可能與 FMR1 mRN

8、A 3'UTR具有相互作用的蛋白：K-Alpha-1及Homo sapiens hypothetical protein，我們推測這兩種蛋白可能通過與FMRl mRNA 3'UTR相互結合而在翻譯水平上對FMR1進行表達調控。 FXR1基因編碼蛋白的系列相互作用蛋白的篩選以及驗證將有助于FXR1基因功能的闡明。本實驗構建了酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌質粒pGBKT7-FXR1，并將其轉化酵母菌AH109，與轉化了Matchmaker人胎腦

9、pGADT7-cDNA文庫質粒的酵母菌Y187進行配合(Mating)，通過一系列報告基因的表達檢測篩選陽性克隆，將經酶切鑒定后陽性克隆質粒AD/Library轉化Y187再與誘餌質粒pGBKT7-FXR1酵母菌進行一對一小交配驗證蛋白質的相互作用，真陽性克隆的AD/Library質粒測序及生物信息學分析，一共得到了七種可能與FXRlP相互作用的蛋白：Btf,SAFB，CMAS，F(xiàn)TH1，GOLGA4，HSD1781，CSH1；隨后進行

10、的免疫共沉淀驗證實驗，構建了4個真核表達載體pCMV-FXR1-Myc，pCMV-Flag-FXR1.pCMV-Btf-Myc，pCMV-SAFB-Myc，對FXR1P與Btf、SAFB的相互作用進行了哺乳動物細胞內的免疫共沉淀驗證，發(fā)現(xiàn)FXR1P與SAFB不能在細胞內發(fā)生相互作用，而能夠與Btf相互作用。據(jù)此，可以認為Btf是FXR1P蛋白調控網絡的新成員，在神經、肌肉等組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮一定的作用。 FXR1基因編碼蛋白

11、的系列相互作用靶mRNA的篩選有助于FXR1P的表達調控功能與FXS發(fā)病機制的探討。本研究應用酵母三雜交技術以構建好的誘餌質粒pYESTrp3/FXR1從人腦海馬回pRH3'-cDNA文庫(RNA表達文庫)中對FXR1P的相互作用mRNA進行了篩選，得到56個His<'+>和LacZ<'+>陽性克隆，將初步獲得的陽性質粒與誘餌質粒一對一重新轉入酵母體內，對RNA-蛋白質相互作用進行回轉驗證，共獲得9個陽性克隆。最后對陽性克隆測序并進行同