5-氮雜胞苷對(duì)KYSE450食管癌細(xì)胞株表觀治療的研究.pdf

1、目的:我們的研究采用低劑量的去甲基化藥物5-氮雜胞苷（5-Azacytidine，5-Aza）對(duì)KYSE450食管癌細(xì)胞株進(jìn)行表觀治療，隨后檢測(cè)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)的表達(dá)與KYSE450食管癌細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)改變情況。探討低劑量的去甲基化藥物5-Aza對(duì)KYSE450食管癌細(xì)胞株是否有效，以及DNMTs的表達(dá)與KYSE450食管癌細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)之間的關(guān)系。
　　方法:1.采用5

2、-Aza不同的藥物濃度處理KYSE450食管癌細(xì)胞株，使用蛋白印記雜交技術(shù)(Westernblotting)檢測(cè)細(xì)胞中γH2AX蛋白表達(dá)，選取不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的相對(duì)最大藥物劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的用藥濃度。2.應(yīng)用甲基化特異性PCR(MethylationSpecificPolymeraseChainReaction，MSP)檢測(cè)用藥前及用藥后不同時(shí)間點(diǎn)DNMT1基因和DNMT3b基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)改變情況。3.應(yīng)用Westernblot

3、檢測(cè)用藥前及用藥后不同時(shí)間點(diǎn)DNMT1基因和DNMT3b基因蛋白表達(dá)改變。4.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QuantitativeRealtimePolymeraseChainReaction,qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)用藥前及用藥后不同時(shí)間點(diǎn)DNMT1基因和DNMT3b基因mRNA的表達(dá)改變。5.應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果:1.應(yīng)用5-Aza處理KYSE450食管癌細(xì)胞72h后，測(cè)得1000nM/L的藥物濃度

4、為不產(chǎn)生藥物毒性的相對(duì)最大劑量。2.KYSE450食管癌細(xì)胞在低劑量的5-Aza治療后，DNMT1、DNMT3b基因甲基化降低，隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先遞減后遞增的趨勢(shì)。3.去甲基化作用能夠增加DNMT1、DNMT3b基因的表達(dá)沉默，使該基因mRNA和蛋白表達(dá)減少，均出現(xiàn)先遞減后遞增的一致趨勢(shì)，并且能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論:1.低劑量的5-Aza對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒副作用，且能逆轉(zhuǎn)DNMT1、DNMT3b甲基化狀態(tài)，為臨