Ezrin-Radixin-Moesin蛋白在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及其對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、研究背景：
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，主要侵犯外周關(guān)節(jié)，病理表現(xiàn)為滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤、血管翳形成，軟骨及骨組織侵蝕性破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、畸形和功能喪失。其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，至今仍無根治方法。研究表明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)通過非炎癥因

2、素依賴的“內(nèi)源性”通路及炎癥因素介導(dǎo)的“外源性”通路活化后其細(xì)胞性質(zhì)發(fā)生改變，如上調(diào)粘附分子、整合素表達(dá)，激活轉(zhuǎn)錄因子，分泌產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶等有害因素，從而導(dǎo)致軟骨和骨的破壞，在RA的發(fā)病機(jī)制中扮演著極為重要的角色。
　　 ERM蛋白包括三個(gè)密切相關(guān)的成員：ezrin，moesin和radixin，屬于蛋白4.1超家族成員，最早作為細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞膜的連接者被發(fā)現(xiàn)，已發(fā)現(xiàn)在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)，

3、其分布有物種特異性和組織細(xì)胞特異性。近年研究表明，ERM除了作為細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞膜的連接者外，還具有豐富的生物學(xué)功能，參與細(xì)胞變形、滲透性改變、增殖、遷移以及凋亡的過程及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 研究表明，RA FLS具有其他成纖維細(xì)胞不具備的特性，其細(xì)胞內(nèi)存在多種與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的基因變異，類似于腫瘤細(xì)胞。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)RAFLS存在明顯的細(xì)胞骨架重排現(xiàn)象，有學(xué)者認(rèn)為此種現(xiàn)象可能參與RA的發(fā)病機(jī)制，而細(xì)胞增殖和凋亡與細(xì)胞骨

4、架重排、變構(gòu)密切相關(guān)。掘此，我們推測(cè)，作為細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜的連接者，ERM蛋白可能參與了RA FLS的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為，但目前尚未見這方面的文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本文擬通過觀察ERM及其磷酸化蛋白在RA滑膜組織中的表達(dá)，研究其是否參與調(diào)控FLS增殖和凋亡的生物學(xué)行為，并探討該過程中可能涉及的信號(hào)機(jī)制來闡明ERM及其磷酸化蛋白在RA發(fā)病中的作用，以期為RA發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供新的思路。
　　 第一部分 ERM在RA滑膜組

5、織和成纖維樣滑膜細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的:觀察ERM及其磷酸化蛋白在RA滑膜組織和FLS中的表達(dá)。
　　 方法:取符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)的RA患者行關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)所得的滑膜組織、符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)的OA患者行關(guān)節(jié)置換術(shù)所得的滑膜組織、因外傷行關(guān)節(jié)修復(fù)術(shù)所得的正常人滑膜組織做細(xì)胞培養(yǎng)和石蠟切片，用組織免疫熒光、組織化學(xué)、免疫印跡等方法觀察ERM及其磷酸化蛋白在滑膜組織和FLS中的表達(dá)，并

6、觀察TNF-α、IL-1β等炎癥因子刺激對(duì)RAFLS磷酸化ERM蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 ERM三種蛋白在滑膜組織中均有表達(dá)，其中在RA滑膜組織中以ezrin最豐富，moesin次之，rαdixin最少；在OA滑膜組織中同樣以ezrin表達(dá)為主，moesin次之，未見radixin表達(dá)；在正常人滑膜組織中ezrin的表達(dá)也較豐富。在滑膜組織中，ERM蛋白主要集中分布于襯里層，但襯里下層也有少量分布，在RA滑膜

7、組織中尤為明顯，主要見于浸潤其中的單個(gè)核細(xì)胞。另外還可以觀察到，在滑膜襯里下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較多radixin和ezrin，不表達(dá)moesin。在RA、OA和正常對(duì)照組滑膜組織均可觀察到磷酸化ERM的表達(dá)信號(hào)，其分布類似于ERM蛋白。與正常人和OA患者相比，RA患者滑膜組織的ERM及其磷酸化蛋白表達(dá)明顯增多。
　　 在體外培養(yǎng)的RA FLS中，可以觀察到ERM蛋白的表達(dá)同樣以ezrin最豐富，moesin次之，radixin

8、最少。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，F(xiàn)LS表達(dá)少量磷酸化ERM蛋白，而炎癥因子TNF-α、IL-1β呈劑量依賴性地明顯上調(diào)磷酸化ERM蛋白表達(dá)，并且在相同濃度和時(shí)間的TNF-α刺激下，RA FLS的磷酸化ERM蛋白表達(dá)量明顯多于OA FLS和正常對(duì)照組。細(xì)胞免疫熒光顯示TNF-α除能上調(diào)磷酸化ERM表達(dá)外，還影響其在細(xì)胞中的分布，刺激后磷酸化ERM主要分布在細(xì)胞膜，而基礎(chǔ)狀態(tài)下則主要分布在細(xì)胞漿中。
　　 結(jié)論:ERM三種蛋白在人滑膜組織和成纖

9、維樣滑膜細(xì)胞中均有表達(dá)，其中以ezrin表達(dá)最豐富。與正常人和OA患者相比，RA患者滑膜組織和FLS中磷酸化ERM蛋白表達(dá)顯著增多，并且炎癥因子TNF-α、IL-1β等能顯著誘導(dǎo)RA FLS磷酸化ERM蛋白的表達(dá)，提示ERM蛋白可能參與RA滑膜炎的發(fā)病機(jī)制。
　　 第二部分RA成纖維樣滑膜細(xì)胞ERM磷酸化的信號(hào)調(diào)控機(jī)制研究
　　 目的:研究TNF-α誘導(dǎo)下RA FLS ERM磷酸化的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:取

10、培養(yǎng)至3～5代并經(jīng)過鑒定的RA FLS，將其分成對(duì)照組、PKC特異性抑制劑bisindolylmaleimideⅠ組、PKC特異性抑制劑R(o)-31-7549組、ROCK特異性抑制劑Y27632組、p38MAPK特異性抑制劑SB203580組，TNF-α組、TNF-α+bisindolylmaleimideⅠ組、TNF-α+R(o)-31-7549組、TNF-α+Y27632組、TNF-α+SB203580組，用免疫印跡法檢測(cè)各組中磷

11、酸化ERM和ERM的表達(dá)。
　　 結(jié)果:p38MAPK特異性抑制劑SB203580、PKC特異性抑制劑R(o)-31-7549、ROCK特異性抑制劑Y27632均能有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的ERM磷酸化，而PKC抑制劑bisindolylmaleimideⅠ則無此作用。此外，上述各種抑制劑對(duì)ERM蛋白表達(dá)沒有影響。
　　 結(jié)論:p38MAPK、PKC、Rho等信號(hào)通路均參與調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的RA FLS ERM磷酸化。<

12、br>　　 第三部分ERM siRNA的構(gòu)建及其對(duì)RA FLS增殖和凋亡的影響
　　 目的:構(gòu)建ERM siRNA，檢測(cè)其對(duì)RA FLS磷酸化ERM表達(dá)的影響，并探討其是否參與調(diào)控RA FLS增殖和凋亡過程及該過程可能涉及的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:設(shè)計(jì)針對(duì)ezrin、radixin、moesin的引物，將其與載體連接構(gòu)建干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)入細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增。用Lipofectein2000將siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)

13、胞中，用RT-QPCR和Western blot法觀察其干擾效果，挑選出干擾效果最佳的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用Western blot法觀察ERM siRNA對(duì)FLS ERM及磷酸化ERM表達(dá)的影響，MTT法及流式細(xì)胞法檢測(cè)其對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響，最后用MTT、Western blot及細(xì)胞免疫熒光法研究磷酸化ERM蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖可能涉及的信號(hào)通路。
　　 結(jié)果：
　　 所構(gòu)建的ezrin、radixin、

14、moesin siRNA可以有效地抑制RA FLS ERM及磷酸化ERM蛋白表達(dá)。同時(shí)，RA FLS的增殖能力及抗凋亡能力均受到顯著抑制，且磷酸化Akt表達(dá)及F-actin聚集亦受到明顯抑制。PI3K/Akt抑制劑LY294002顯著抑制F-actin聚集。
　　 結(jié)論:磷酸化ERM蛋白能促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖，并且抑制其凋亡，該過程可能是通過激活磷酸化Akt和促進(jìn)F-actin聚集實(shí)現(xiàn)的，提示通過抑制ERM磷酸化