β-分泌酶抑制劑篩選與評(píng)價(jià)體系的建立及活性化合物篩選.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)慢性神經(jīng)退行性疾病,臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶衰退、高級(jí)認(rèn)知功能障礙及運(yùn)動(dòng)能力受損,其病理學(xué)特征包括神經(jīng)元外主要由聚集的β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)組成的老年斑(senile plaques,SPs)和細(xì)胞內(nèi)含高度磷酸化tau蛋白的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tan

2、gles,NFTs),以及營養(yǎng)不良突起、廣泛的神經(jīng)元丟失和神經(jīng)膠質(zhì)增生。
　　AD的發(fā)病機(jī)制迄今尚不十分清楚,但從上世紀(jì)90年代至今,以Aβ過度積聚為核心的Aβ學(xué)說一直占據(jù)著AD發(fā)病機(jī)制及新藥研究的主流方向,為攻克AD這一頑癥帶來了曙光。然而,迄今為止,美國FDA批準(zhǔn)用于AD治療的藥物僅有兩類,即膽堿脂酶抑制劑(cholinesterase inhibitors,ChEIs)和NMDA受體(N-methyld-D-aspartat

3、e receptor,NMDA receptor)拮抗劑,只能改善癥狀,卻不能延緩或阻斷疾病進(jìn)展。而以抑制Aβ產(chǎn)生、沉積或促進(jìn)Aβ清除為主的藥物被認(rèn)為可通過中止或逆轉(zhuǎn)AD病理改變而起到根本的治療作用,因而是目前抗AD藥物研究開發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和主要攻關(guān)方向。β-分泌酶(β-site APP cleaving enzyme1,BACE1)是催化裂解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)生成Aβ的重要限速酶

4、。已有研究表明, BACE1基因敲除的小鼠腦內(nèi)無Aβ產(chǎn)生,但生活基本正常,表明可以通過抑制BACE1而阻斷或降低 Aβ的產(chǎn)生來治療 AD,且不會(huì)帶來明顯的不良反應(yīng),因而BACE1被認(rèn)為是開發(fā)AD治療藥物的相對(duì)理想靶標(biāo),其抑制劑的開發(fā)已成為藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。
　　本研究建立了包括體外分子水平、細(xì)胞水平及整體動(dòng)物水平在內(nèi)的系統(tǒng)的β-分泌酶抑制劑篩選與評(píng)價(jià)體系,并對(duì)本所七室設(shè)計(jì)合成的一系列新結(jié)構(gòu)化合物及本室前期從中藥復(fù)方中提取的活性組分或

5、成分進(jìn)行了篩選,為基于抑制β-分泌酶活性的抗 AD藥物的研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　第一部分β-分泌酶抑制劑篩選與評(píng)價(jià)體系的建立
　　一、體外分子水平β-分泌酶抑制劑高通量篩選體系的建立
　　體外分子水平主要考察待測樣品對(duì)BACE1活性的抑制作用。1.體外分子水平β-分泌酶抑制劑高通量篩選體系的建立
　　采用均相時(shí)間分辨熒光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)法

6、建立了β-分泌酶抑制劑高通量篩選體系,方法參數(shù)確定為:反應(yīng)總體積為42μL,包括:15μL BACE1反應(yīng)液(0.67 mU/μL)、15μL BACE1底物反應(yīng)液(400 nmol/L)、2μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)/待測樣品(或陽性對(duì)照)、10μL終止液;反應(yīng)時(shí)間為6hr、BACE1濃度為0.67 mU/μL,采用VICTOR3酶標(biāo)儀測得其信噪比(signal-to-noise ratio,S/

7、N)為649.6,信背比(signal-to-background ratio,S/B)為44.6,Z’因子為0.91,變異系數(shù)(Coefficient of Variation,CV)小于10％。
　　2.體外分子水平β-分泌酶抑制劑高通量篩選體系的驗(yàn)證
　　以文獻(xiàn)公開發(fā)表的BACE1抑制劑表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-Epigallocatechin gallate,EGCG)驗(yàn)證所建立的高通量篩選體系,采用VICT

8、OR3多功能酶標(biāo)儀所測得EGCG抑制BACE1的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitory concentration,IC50)為7.57×10-7 M,與文獻(xiàn)報(bào)道一致,而FLUOstar OPTIMA多功能酶標(biāo)儀檢測結(jié)果無法擬合出 EGCG對(duì)BACE1的IC50。因此,在后續(xù)研究中,確定初篩時(shí)采用EGCG為陽性對(duì)照藥,并使用VICTOR3多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。
　　二、細(xì)胞水平β-分泌酶抑制劑篩選與評(píng)價(jià)體系的建立
　　在細(xì)

9、胞水平對(duì)所得活性化合物進(jìn)一步篩選主要從兩方面進(jìn)行,一是測定化合物在細(xì)胞水平對(duì)β-分泌酶活性的影響,二是測定化合物對(duì)細(xì)胞Aβ分泌水平的影響。
　　1.基于β-分泌酶活性測定的篩選方法的建立
　　本研究分別采用FRET法和TRF法通過考察蛋白用量及檢測時(shí)間,建立了細(xì)胞內(nèi)源β-分泌酶活性檢測方法。結(jié)果表明,TRF法和FRET法均可用于內(nèi)源性β-分泌酶活性檢測,TRF法本身檢測下限低于FRET法,且檢測時(shí)間更靈活,但用于內(nèi)源β-分泌

10、酶活性檢測時(shí)TRF法檢測下限不及FRET法。
　　2.基于Aβ分泌水平測定的篩選方法的建立
　　為進(jìn)一步評(píng)價(jià)篩選獲得的具有抑制BACE1活性的化合物對(duì)細(xì)胞Aβ分泌的影響,本研究建立了細(xì)胞水平的Aβ檢測方法。
　　采用AlphaLISA法建立基于細(xì)胞Aβ分泌水平測定的篩選方法,該法檢測限為0.1-100ng/mL;將體系中受體微珠、供體微珠和待測樣品(及標(biāo)準(zhǔn)品)用量減半后相同樣品Aβ1-40濃度檢測結(jié)果與原體系一致,因而

11、體系減半后可在保證檢測準(zhǔn)確性和靈敏度的前提下進(jìn)一步提高其通量,從而極大地降低實(shí)驗(yàn)成本。
　　三、動(dòng)物水平β-分泌酶抑制劑篩選與評(píng)價(jià)體系的建立
　　為了探討快速老化模型小鼠(senescence-accelerated mouse,SAM)腦內(nèi)β-分泌酶活性的變化及其與Cat D、Cat B活性的關(guān)系,進(jìn)而采用該模型進(jìn)行β-分泌酶抑制劑的篩選與評(píng)價(jià),本研究首先觀察了增齡過程中快速老化模型小鼠亞系(SAM-prone/8,SAM

12、P8)和抗快速老化模型小鼠亞系(SAM-resistant/1,SAMR1)海馬和皮層內(nèi)β-分泌酶、Cat D和Cat B活性的動(dòng)態(tài)變化,并采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)技術(shù)對(duì)其mRNA的表達(dá)進(jìn)行了觀察。
　　1.SAM增齡過程中腦內(nèi)β-分泌酶、Cat D和Cat B活性變化
　　1.1β-分泌酶活性
　　采用FRET法檢測SAM皮層內(nèi)源β-分泌酶活性時(shí),蛋白樣品用量為0.125～0.5

13、μg,檢測時(shí)間為1～2hr。
　　研究結(jié)果表明,SAMR1和SAMP8皮層β-分泌酶活性皆隨增齡而升高,但品系間無明顯差異。
　　與2月齡相比,SAMR1與SAMP8海馬β-分泌酶活性均顯著升高后明顯降低,且6月齡和12月齡SAMP8海馬β-分泌酶活性明顯高于同月齡SAMR1。
　　1.2 Cat D和Cat B活性
　　采用FRET法建立SAM皮層組織蛋白酶D(Cathepsin D,Cat D)和組織蛋白酶B

14、(Cathepsin B,Cat B)活性檢測的方法,結(jié)果表明,組織蛋白樣品用量均為3.13～50μg,檢測時(shí)間擬選用1-2hr。
　　SAMR1皮層Cat D活性隨增齡無明顯變化;SAMP8皮層Cat D活性隨增齡顯著升高;但品系間無明顯差異。而SAMR1與SAMP8海馬Cat D活性隨增齡增加無明顯變化且品系間無顯著差異。
　　SAMR1與SAMP8大腦皮層及海馬Cat B活性隨月齡增加均無明顯變化,且品系間無顯著差異。

15、
　　相關(guān)性分析表明,SAM腦內(nèi)Cat B活性隨增齡變化與β-分泌酶活性相關(guān)性較小,Cat D活性隨增齡變化與β-分泌酶活性顯著相關(guān)。
　　2.SAM增齡過程中其腦內(nèi)BACE1、Cat D和Cat B的mRNA表達(dá)變化
　　本研究采用RT Q-PCR技術(shù)對(duì)2、6、12月齡雄性SAMR1和SAMP8大腦皮層和海馬BACE1、Cat D和Cat B的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了檢測,結(jié)果如下:
　　2.1 BACE1 mR

16、NA表達(dá)
　　SAMR1和SAMP8大腦皮層中BACE1 mRNA表達(dá)隨月齡增加無顯著變化。SAMR1海馬中BACE1 mRNA表達(dá)水平隨月齡增加顯著降低,而SAMP8海馬中BACE1 mRNA表達(dá)水平隨月齡增加無明顯變化;12月齡SAMP8海馬BACE1 mRNA表達(dá)水平顯著高于同月齡SAMR1。
　　2.2 Cat D mRNA表達(dá)
　　SAMR1和SAMP8大腦皮層Cat D mRNA的表達(dá)隨月齡增加無明顯變化,

17、但2月齡SAMP8顯著高于同月齡SAMR1;SAMR1海馬Cat D mRNA表達(dá)隨月齡增加顯著降低, SAMP8海馬Cat D mRNA表達(dá)隨月齡增加無明顯變化,且品系間無顯著差異。
　　2.3 Cat B mRNA表達(dá)
　　SAMR1和SAMP8大腦皮層Cat B mRNA表達(dá)水平隨月齡增加無明顯變化,但2和6月齡SAMP8明顯高于同月齡SAMR1;SAMR1 Cat B mRNA表達(dá)水平隨月齡增加顯著降低, SAMP8

18、海馬Cat B mRNA表達(dá)水平隨月齡增加無明顯變化,且品系間無顯著差異。
　　第二部分β-分泌酶抑制劑的篩選
　　一、GSY系列化合物的篩選
　　采用所建立的β-分泌酶抑制劑篩選體系從GSY系列10個(gè)化合物中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)IC50不超過10-6M的化合物,其中2個(gè)化合物IC50不超過10-9M,目前正在進(jìn)行細(xì)胞水平篩選與評(píng)價(jià)。
　　二、H系列化合物的篩選
　　采用所建立的β-分泌酶抑制劑篩選體系從H系列103

19、個(gè)化合物中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)IC50不超過10-6M的化合物;進(jìn)而采用改進(jìn)的HTRF法對(duì)H系列3個(gè)化合物即H1712、H0412、H0312的篩選結(jié)果進(jìn)行了排除,并選擇公開發(fā)表的BACE1抑制劑EGCG和化合物3以及活性化合物013和015作為參照。結(jié)果顯示,H1712、H0412、H0312本身具有較強(qiáng)熒光淬滅作用,對(duì)BACE1抑制作用很可能為假陽性結(jié)果,且EGCG對(duì)BACE1的抑制作用也可能由于熒光淬滅作用所致;而化合物013和015及陽性

20、化合物3對(duì)BACE1活性具有明顯抑制作用。
　　三、擬肽類化合物的篩選
　　對(duì)32個(gè)擬肽類化合物進(jìn)行了篩選,化合物濃度為10-6M時(shí)對(duì)BACE1活性抑制率未超過50％,表明該系列化合物對(duì)BACE1無明顯抑制作用。
　　四、中藥復(fù)方與組分的篩選
　　對(duì)當(dāng)歸芍藥散和其活性部位 JD30及其活性成分之一芍藥苷進(jìn)行了篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸芍藥散和JD30對(duì)BACE1抑制作用量效關(guān)系良好,而其活性成分芍藥苷對(duì)BACE1活性沒有

21、影響。
　　五、其他化合物的篩選
　　對(duì)其他8個(gè)化合物進(jìn)行了篩選,化合物濃度為10-6M時(shí)對(duì)BACE1最高抑制率不超過10％,表明這些化合物對(duì)BACE1無明顯抑制作用。
　　總之,本研究建立了包括分子、細(xì)胞及動(dòng)物水平在內(nèi)的系統(tǒng)的β-分泌酶抑制劑篩選與評(píng)價(jià)體系,并在分子水平完成了156個(gè)待測樣品的篩選;本研究結(jié)果一方面為揭示SAMP8腦內(nèi)Aβ沉積的分子機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),佐證了SAMP8是一個(gè)研究AD發(fā)病機(jī)制和用于評(píng)