骨碎補(bǔ)對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 牙周病是危害人類健康的兩大口腔疾病之一，主要由感染、創(chuàng)傷、遺傳等多種致病因素引起，這些致病因素破壞牙齒的支持結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落，因此牙周病是成人失牙的主要原因。牙周病治療是以修復(fù)牙周組織缺損、恢復(fù)牙周組織正常結(jié)構(gòu)和功能為最終目標(biāo)，目前常規(guī)的治療方法卻難以達(dá)到理想的組織再生效果。牙周組織再生的基礎(chǔ)是牙槽骨和牙骨質(zhì)的再生，存在的難題是病損局部能夠參與骨組織再生的細(xì)胞來(lái)源有限，數(shù)量不足。繼引導(dǎo)組織再生術(shù)后，組織工程技

2、術(shù)的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)牙周組織完全再生提供了新的思路，成為研究熱點(diǎn)之一。組織工程學(xué)的基本方法是將體外培養(yǎng)的正常組織細(xì)胞擴(kuò)增后吸附于生物相容性良好，并可被人體逐步降解吸收的生物材料上，形成細(xì)胞一生物材料復(fù)合物，將這一復(fù)合物植入機(jī)體組織、器官缺損部位，種植的細(xì)胞在生物支架材料逐步降解吸收的過(guò)程中，繼續(xù)增殖并形成新的具有原有特殊形態(tài)和功能的組織器官，達(dá)到修復(fù)組織器官的缺損和重建其功能的目的。組織工程技術(shù)的關(guān)鍵是獲得大量功能相關(guān)的種子細(xì)胞。已有學(xué)者嘗試

3、引入骨組織工程技術(shù)治療牙周組織缺損，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了初步的成效<'[1]>。但既往常采集骨、骨膜、骨髓來(lái)源的種子細(xì)胞大都存在取材不易，對(duì)機(jī)體損傷較大的缺點(diǎn)。有實(shí)驗(yàn)證明<'[2]>，某些來(lái)源于骨外組織的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞等，在誘導(dǎo)因子的持續(xù)作用下，可以向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化并保持其成骨能力。但成纖維細(xì)胞的成骨能力是有條件的，即必須在特定條件影響下才能表現(xiàn)出其成骨特征。摸索促使成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化并保持其成骨能力的適宜條件，須體外進(jìn)行活細(xì)胞

4、實(shí)驗(yàn)。在牙周組織中最主要的兩種成纖維細(xì)胞是牙齦及牙周膜成纖維細(xì)胞。有研究表明，人牙周膜細(xì)胞具備多向分化潛能，因其在適宜誘導(dǎo)條件下能表達(dá)成骨細(xì)胞表型并能在體外培養(yǎng)中形成礦化組織<'[3]>而成為牙周組織再生中較為理想的種子細(xì)胞，但其來(lái)源有限，取材不易，且較難繁育。而牙齦成纖維細(xì)胞作為牙周組織的組成成分，來(lái)源豐富、容易獲得、具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)和自我繁殖能力，雖較牙周膜細(xì)胞表達(dá)成骨表型及礦化的能力較弱，但可以設(shè)想，只要能對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞施以有效的

5、誘導(dǎo)因素，使其表達(dá)成骨細(xì)胞表型，則有望用牙齦成纖維細(xì)胞替代牙周膜細(xì)胞，成為牙周組織修復(fù)再生中理想的種子細(xì)胞。 骨碎補(bǔ)為傳統(tǒng)的中國(guó)骨傷科常用中藥，具有補(bǔ)腎、活血、止痛、續(xù)骨療傷之功效，其可促進(jìn)體外成骨細(xì)胞增殖、分化、鈣化。本實(shí)驗(yàn)擬利用骨碎補(bǔ)獨(dú)特的藥理作用，將其作為一種誘導(dǎo)因子作用于體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞，通過(guò)觀察對(duì)比所培養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性及細(xì)胞周期的改變，探索骨

6、碎補(bǔ)對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞成骨表型的體外誘導(dǎo)作用等生物學(xué)特性的影響，骨碎補(bǔ)的藥物濃度效應(yīng)及最佳作用濃度等問(wèn)題，為將來(lái)骨碎補(bǔ)誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨表型、代替牙周膜細(xì)胞應(yīng)用于組織工程促進(jìn)牙周組織再生提供一定的理論依據(jù)，為其作為一種新型的誘導(dǎo)因子應(yīng)用于人牙周組織工程領(lǐng)域提供新思路。 方法： 采用組織塊法分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞，制備骨碎補(bǔ)提取液作用于細(xì)胞，通過(guò)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、ALP活性、細(xì)胞周期的改變，探討骨碎補(bǔ)對(duì)細(xì)胞的體

7、外誘導(dǎo)作用。 1 人牙齦成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代及來(lái)源鑒定選取需進(jìn)行正畸減數(shù)拔牙的青少年健康牙齦，采用組織塊法進(jìn)行牙齦成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底80％時(shí)進(jìn)行傳代。經(jīng)傳代后獲得大量可供實(shí)驗(yàn)用的種子細(xì)胞。 取第2代細(xì)胞進(jìn)行角蛋白染色及波形絲蛋白染色，做來(lái)源鑒定。 2 骨碎補(bǔ)提取液的制備將骨碎補(bǔ)加適量水煎煮，過(guò)濾，濃縮，醇沉，活性炭脫色，過(guò)濾除菌。所得提取液用含2％胎牛血清(Fetal boyine

8、serum，F(xiàn)BS)的DMEM(dulbecco's modifled eagle medium)培養(yǎng)液稀釋成5個(gè)不同的終濃度。調(diào)整PH至7.0～7.1，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入骨碎補(bǔ)提取液，對(duì)照組加入含2％FBS的DMEM培養(yǎng)液。 4 ALP活性測(cè)定取第4代人牙齦成纖維細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為5個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組4孔。培養(yǎng)7d，棄孔內(nèi)液體，加入Triton X

9、-100，4℃過(guò)夜后，取上述各孔液體及空白對(duì)照的雙蒸水一并轉(zhuǎn)入另一96孔板。按ALP試劑盒說(shuō)明依次按比例加入緩沖液、基質(zhì)液，水浴，加入顯色劑后在酶聯(lián)儀上于410 nm波長(zhǎng)下測(cè)0D值，取每組4孔的平均值，間接反映細(xì)胞的ALP活性，以活性最高組骨碎補(bǔ)的濃度為最佳濃度用于以下實(shí)驗(yàn)。 5 形態(tài)學(xué)觀察 5．1在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞游出及生長(zhǎng)狀況，并行吉姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。 5．2掃描電鏡觀察取第5代生長(zhǎng)狀態(tài)良

10、好的人牙齦成纖維細(xì)胞，接種于預(yù)先放有蓋玻片的6孔板中。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用最佳濃度骨碎補(bǔ)提取液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d，取出蓋玻片，洗滌固定，常規(guī)制備樣品，掃描電鏡觀察。 5．3透射電鏡觀察取第5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人牙齦成纖維細(xì)胞，接種在50 ml培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用最佳濃度骨碎補(bǔ)提取液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，洗滌固定，常規(guī)制備樣品，透射電鏡觀察。 6 測(cè)定細(xì)胞周期取第6代生

11、長(zhǎng)狀態(tài)良好的人牙齦成纖維細(xì)胞，接種于50ml培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3瓶。實(shí)驗(yàn)組用最佳濃度骨碎補(bǔ)提取液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d，將細(xì)胞消化、離心，70％冰乙醇固定后流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用單因素方差分析方法對(duì)ALP檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)對(duì)細(xì)胞周期結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

12、。 結(jié)果 1 采用組織塊原代培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出人牙齦成纖維細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察，接種3～7 d有細(xì)胞從組織塊周圍游出，放射狀排列。14 d時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)約鋪滿培養(yǎng)瓶底的80％，以1：1進(jìn)行首次傳代。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，約7～10 d傳代一次。 2 傳代時(shí)經(jīng)消化后的細(xì)胞回縮呈小球形，折光性好，4 h左右開(kāi)始伸展，24 h后細(xì)胞大部分貼壁，伸展成均一的梭形。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至14 d，細(xì)胞生長(zhǎng)密集時(shí)可出現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)。

13、 3 ALP檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組ALP的0D值均高于對(duì)照組(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組骨碎補(bǔ)濃度為100μg/ml時(shí)其ALP活性最佳。 4 吉姆薩染色可見(jiàn)細(xì)胞胞核呈藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色，均勻，胞體豐滿伸展良好，核圓，核仁清晰。 掃描電鏡觀察，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞表面有豐富的枝狀嵴，交織成網(wǎng)狀，嵴上附大量微小囊泡。細(xì)胞周圍可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)。 透射電鏡觀察，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞器增多，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的

14、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和游離核糖體等。細(xì)胞核內(nèi)常染色質(zhì)均勻分布，異染色質(zhì)較少。 5 細(xì)胞周期檢測(cè)，經(jīng)骨碎補(bǔ)作用后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組G<,1>期細(xì)胞減少，S期和G<,2>M期細(xì)胞增多，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組增殖指數(shù)PrI值高于對(duì)照組(P<0.05)。 結(jié)論 1 采用組織塊法可成功培育出人牙齦成纖維細(xì)胞，原代及傳代細(xì)胞呈均一的成纖維細(xì)胞樣，生長(zhǎng)旺盛，分裂較快，可出現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)中所需大量的種子細(xì)胞。 2 中藥骨