骨髓間充質干細胞制備移植用胰島素分泌細胞的實驗研究.pdf

1、本實驗旨在通過誘導分化和基因工程修飾骨髓間充質干細胞，從而獲得胰島素分泌細胞，可能會成為治療I型糖尿病的有效手段。 從健康成年志愿者骨髓中分離出骨髓間充質干細胞并在體外擴增培養(yǎng)，一方面，在某些誘導劑的誘導下分化為胰島p樣細胞。另一方面，通過逆轉錄病毒載體將外源性胰島素基因導入骨髓間充質干細胞，并穩(wěn)定表達和分泌胰島素，將此種基因工程修飾的骨髓間充質干細胞移植到糖尿病大鼠模型體內，能夠在一定程度上控制糖尿病。 整個研究分成四

2、個部分： 第一部分hMSCs的體外分離培養(yǎng)和生物學特性。 目的：建立一種成人骨髓間充質干細胞體外分離、培養(yǎng)和擴增的方法，并探討其部分生物學特性。 方法：利用密度為1．073的Percoll分離液，通過密度梯度離心法結合hMSCs貼壁生長的特性，從成人紅骨髓中分離出hMSCs并接種于纖維連接蛋白包被、含有表皮生長因子和血小板源性生長因子BB的低濃度血清(2％FBS)培養(yǎng)液中擴增，通過倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡、

3、透射電鏡、流式細胞儀分析hMSCs的生物學特性。 結果：原代和傳代培養(yǎng)均保持較強的增殖能力，超微結構顯示了干細胞的幼稚特性，流式細胞儀檢測顯示CD34、CD45、HLA-DR陰性，CDl0、CDl3、CD29、CD44陽性。 結論：采用該方法，骨髓間充質干細胞生長穩(wěn)定，擴增較快。 第二部分hMSCs體外誘導分化成胰島素分泌細胞的初步研究。 目的：研究成人骨髓間充質干細胞體外誘導分化成為胰島素分泌細胞的可能

4、性。 方法：采用Percoll分離液和差異貼壁法分離純化成人骨髓間充質干細胞，培養(yǎng)傳代后，先后用堿性成纖維細胞生長因子、B27添加劑、尼克酰胺等誘導，放免法檢測培養(yǎng)液中胰島素含量，雙硫腙和免疫細胞化學進行鑒定，并進行體外細胞功能測定。 結果：誘導第二周細胞聚集成胰島樣細胞團，開始分泌胰島素，雙硫腙染色成猩紅色，免疫熒光顯示細胞表達胰島素，體外葡萄糖刺激胰島素釋放試驗陽性。 結論：成人骨髓間充質干細胞可以在體外一定

5、條件下實現(xiàn)向胰島素分泌細胞轉分化。 第三部分外源性胰島素基因在hMSCs內穩(wěn)定表達的研究。 目的：構建攜帶人胰島素基因的逆轉錄病毒載體，使外源性人胰島素基因在人骨髓間充質干細胞內穩(wěn)定表達。 方法：通過RT-PCR法從人胰腺組織中獲得人胰島素基因，并將其連接入逆轉錄病毒載體pLNCX，經過包裝細胞PT67的包裝后，獲得攜帶外源性人胰島素基因的逆轉錄病毒上清液(病毒滴度達4-6×106cfu／m1)。將攜帶外源性人胰

6、島素基因的逆轉錄病毒轉染hMSCs,經過G418篩選出被轉染的細胞株并大量擴增。利用RT-PCR法、免疫熒光法、放射免疫法、葡萄糖刺激試驗分析被轉染的hMSCs對外源胰島素基因的轉錄、表達和分泌。 結果：攜帶人胰島素基因的逆轉錄病毒載體構建成功，轉導入hMSCs后能夠穩(wěn)定表達胰島素基因，并分泌至細胞外持續(xù)3周以上，對葡萄糖刺激試驗陰性。 結論：人胰島素基因能夠被連接到逆轉錄病毒載體pLNCX中去，重組人胰島素基因逆轉錄病

7、毒能夠轉導入hMSCs并穩(wěn)定表達。 第四部分：表達外源性胰島素基因的hMSCs移植治療大鼠糖尿病 目的：建立SD大鼠糖尿病模型，將穩(wěn)定表達人胰島素基因的人骨髓間充質干細胞移植入糖尿病大鼠體內，觀察治療糖尿病的效果。 方法：通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導健康SD大鼠建立糖尿病模型；將轉基因hMSC體外擴增后注射到動物模型的腎包膜下，檢測移植前后血糖、血清胰島素、C肽、體重、尿量、生存時間變化及腹腔糖耐量實驗(

8、IPGT)，以評價治療糖尿病的效果。 結果：STZ誘導大鼠后，大鼠血糖顯著上升，胰島素水平下降，出現(xiàn)典型的多飲、多食、多尿、體重下降等癥狀，生存時間縮短。將轉基因胰島素分泌hMSC移植到大鼠腎包膜下后，大鼠的血糖水平下降，胰島素、C肽、體重水平上升，糖尿病癥狀得到控制，生存時間明顯延長，IPGT接近正常水平。 結論：轉基因hMSC在糖尿病大鼠體內均可以合成與分泌有生物活性的胰島素，有效控制大鼠糖尿病癥狀，延長生存時間。對