甲狀腺素對氣道黏蛋白5AC基因表達的影響及其調(diào)控機制.pdf

1、目的： 觀察甲狀腺素對氣道上皮細胞黏蛋白(mucin，MUC)5AC表達的影響及其調(diào)控機制。 方法： 1、MUC5AC在A549細胞中的表達：體外培養(yǎng)A549細胞，以不同濃度的甲狀腺素刺激A549細胞24h后，用ELISA法檢測上清液中MUC5AC蛋白含量，用RT-PCR法檢測細胞中MUC5ACmRNA水平。 2、設計、構(gòu)建MUC5AC基因5’上游序列的表達質(zhì)粒：根據(jù)MUC-5AC基因5’調(diào)控區(qū)的DNA序

2、列、表達載體pGL3質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點及實驗需要設計PCR擴增引物，以人基因組總DNA為模板擴增MUC5AC基因5’非編碼區(qū)片段，雙酶切后插入pGL3質(zhì)粒構(gòu)成重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測序鑒定證實構(gòu)建成功后，用脂質(zhì)體將表達質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細胞，培養(yǎng)24h后，加入甲狀腺素(濃度為6.5ng/ml)處理，繼續(xù)孵育24h收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定報告基因的表達水平。 結(jié)果： 1、用ELISA法

3、檢測A549細胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC蛋白的表達顯示，甲狀腺素可成濃度、時間依賴性地使A549細胞MUC5AC蛋白表達水平下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。用RT-PCR法檢測MUC5ACmRNA表達顯示，甲狀腺素處理組A549細胞MUC5AC mRNA相對表達量明顯低于對照組。 2、成功構(gòu)建了4種含有MUC5AC基因啟動子序列的表達質(zhì)粒，分別導入A549細胞后予甲狀腺素刺激，觀察到甲狀腺素可抑制重組質(zhì)粒pGL3-MUC5A

4、C-1330/+48、pGL3-MUC5AC-1250/+48熒光素酶的表達，而不能抑制重組質(zhì)粒pGL3-MUC5AC.1200/+48、pGL3-MUC5AC-1020/+48熒光素酶的表達。 結(jié)論： 1、甲狀腺素可抑制A549細胞黏蛋白MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成分泌，甲狀腺素在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制MUC5AC表達。 2、成功地構(gòu)建了四種含人MUC5AC基因啟動子系列截短的熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒，為研究甲狀腺