益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)糖尿病大鼠不同時(shí)期腎臟組織bax和bcl-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病( Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病及糖尿病患者死亡的主要原因，因此，有效防治DN的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。本研究通過腹腔注射STZ法建立糖尿病大鼠模型，之后應(yīng)用益氣養(yǎng)陰活血(Tonify-qi andnourish-yin, promote blood circulation, TNPC)法對(duì)該模型進(jìn)行干預(yù)，通過觀察血糖(Glucose,GLU)，

2、總膽固醇(Total cholesterol,TC)，甘油三脂(Triglyceride,TG),24小時(shí)尿白蛋白排泄率(Urinary albumin excretionrate,UAER)，血尿素氮（BUN）、肌酐清除率(Ccr)，腎臟病理形態(tài)學(xué)變化以及腎組織中bax與bcl-2的水平，研究該法對(duì)DN的防治作用及其可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。
　　 方法：選用清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠50只，體重200

3、g±10g，普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)一周，檢測(cè)尿糖和尿蛋白均為陰性，空腹12小時(shí)后，隨機(jī)取38只造模，將新制成的1％的鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)溶液，按55mg/kg腹腔注射，剩余的12只為正常對(duì)照組(The Normal ControlGroup,NCG)，注射同量的0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液。72小時(shí)后，分三日分別測(cè)38只模型大鼠隨機(jī)血糖三次，當(dāng)其中有兩次血糖≥16.7mmol/L時(shí)，確認(rèn)糖尿病大鼠造模型成功，

4、隨機(jī)分為糖尿病模型組(Model Group，MG)，厄貝沙坦治療組(Irbesartan Group，IBG)，中藥治療組(Chinese MedicineTreatment Group,CMG)，各12只。各治療組(Treatment Group)在造模成功一周后開始按成人劑量的10倍給藥，每日一次。中藥組給予益氣養(yǎng)陰活血方，按32g/(kg·d)灌胃，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦片按25mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組均以相應(yīng)量的

5、生理鹽水灌胃。給藥8周(8 weeks，8w)后從四組中各隨機(jī)取6只處死，其余6只12周(12 weeks,12w)后處死。處死前一天將大鼠置于代謝籠，收集24小時(shí)尿液，記尿總量，并測(cè)尿白蛋白排泄率，尿肌酐。12小時(shí)禁食水，稱體重（Body Weight,BW），斷尾測(cè)血糖，以2％戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)股動(dòng)脈取血，分別測(cè)總膽固醇、甘油三脂、血尿素氮(BUN)、肌酐清除率(Ccr)。處死動(dòng)物，取出右側(cè)腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱

6、重，記錄腎重（Kidney Weight，KW）并計(jì)算肥大指數(shù)（腎重/體重，KW/BW）；取部分腎組織于4％多聚甲醛中固定，用于常規(guī)病理觀察及免疫組織化學(xué)檢測(cè)bax、bcl-2的表達(dá)，并用病理圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1實(shí)驗(yàn)大鼠的一般狀況
　　 正常組大鼠飲食正常，精神狀態(tài)好，反應(yīng)敏捷，尿量正常，體重明顯增加。其余三組注射STZ后，均出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，并慢慢出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)

7、遲鈍、少動(dòng)、皮毛無光澤、體型瘦小。12周時(shí)上述表現(xiàn)較8周時(shí)明顯，其中以模型組最為顯著。在注射STZ后3～5天，造模組有2只大鼠死亡，死亡原因可能為高血糖引起代謝紊亂，最終導(dǎo)致臟器衰竭。
　　 2各組大鼠24小時(shí)尿白蛋白排泄率
　　 8周和12周時(shí)，糖尿病組大鼠24小時(shí)尿白蛋白排泄率，較同期對(duì)照組比較均有明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01、p＜0.05)。厄貝沙坦組、中藥組比模型組低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。厄貝沙

8、坦組與中藥組之間，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。糖尿病組12周與8周比較，變化不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 3各組血糖、總膽固醇、甘油三脂
　　 8周和12周時(shí)糖尿病組大鼠血糖、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)較同期對(duì)照組大鼠明顯增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。厄貝沙坦組、中藥組與模型組相比有差異(p＜0.05)，厄貝沙坦組與中藥組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。12周與8周比較，各治療組血糖、

9、TC和TG均有所降低，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 4各組大鼠腎功能（BUN、肌酐清除率）
　　 8周和12周時(shí)，糖尿病組大鼠血尿素氮升高和肌酐清除率的降低，較同期對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。在厄貝沙坦組與中藥組，血尿素氮比模型組低，肌酐清除率比模型組高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。厄貝沙坦組與中藥組比較無差別(p＞0.05)。12周與8周比較，各治療組血尿素氮降低，肌酐清除率增加，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

10、＞0.05)。
　　 5各組大鼠體重、右腎重、肥大指數(shù)( KW/BW)
　　 8周和12周時(shí)，糖尿病組大鼠體重下降、右腎重和肥大指數(shù)增加，較同期對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。厄貝沙坦組和中藥組較模型組變化明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。厄貝沙坦組和中藥組之間，無差別(p＞0.05)。12周與8周比較，模型組、厄貝沙坦組和中藥組，體重、右腎重變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；肥大指數(shù)變化，均無意義(p＞0.05)

11、。
　　 6腎臟病理形態(tài)光鏡觀察
　　 常規(guī)病理學(xué)觀察：光鏡下觀察，HE和Masson染色，糖尿病組大鼠較對(duì)照組腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增多，系膜細(xì)胞輕度增生，部分腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性。12周時(shí)，還可見部分腎小管萎縮，部分?jǐn)U張，透明管型形成，腎小球及腎小管基底膜增厚，基質(zhì)增寬，纖維組織增生，球囊粘連。
　　 7免疫組織化學(xué)檢測(cè)bax、bcl-2表達(dá)
　　 7.1光鏡下觀察
　　 Bax在腎組

12、織中的表達(dá)：正常對(duì)照組表達(dá)于腎小球的足細(xì)胞、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、集合管等上皮細(xì)胞胞漿中；糖尿病組，在足細(xì)胞增加，遠(yuǎn)曲小管及小管間質(zhì)細(xì)胞明顯增加，8周時(shí)治療組較模型組在近曲小管及遠(yuǎn)曲小管的表達(dá)減少，12周時(shí)在遠(yuǎn)曲小管各段明顯減少。
　　 Bcl-2在對(duì)照組主要表達(dá)于近曲小管各段和皮髓交界處，遠(yuǎn)曲小管和集合管有少許表達(dá)；糖尿病組，在部分近曲小管明顯減少，而部分近曲小管的表達(dá)未見明顯變化。8周時(shí)治療組較模型組，在近曲小管近段略有增加，

13、在遠(yuǎn)端小管明顯增加；12周時(shí)在近曲小管表達(dá)呈明顯強(qiáng)陽性，皮髓交界處表達(dá)較高。
　　 7.2病理圖象半定量分析：
　　 8周和12周時(shí)，與正常對(duì)照組比較，bax的表達(dá)在模型組(P＜0.01)、厄貝沙坦組(P＜0.05)、中藥組(P＜0.05)腎組織內(nèi)的水平均明顯增加；厄貝沙坦組與中藥組明顯低于模型組(P＜0.01)；中藥組和厄貝沙坦組之間無明顯差別(P＞0.05)。12周與8周比較，模型組增加(P＜0.05)，中藥組、厄貝

14、沙坦組減少(P＜0.01)，正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8周和12周時(shí)bcl-2的表達(dá)在模型組、厄貝沙坦組、中藥組表達(dá)均明顯增加(P＜0.05)；厄貝沙坦組與中藥組高于模型組(P＜0.01)，中藥組和厄貝沙坦組之間無明顯差別(P＞0.05)。12周與8周比較，模型組減少(P＜0.01)、中藥組和厄貝沙坦組增加(P＜0.05)，正常組變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8周和12周時(shí)，Bax/Bcl-

15、2，在模型組、中藥組和厄貝沙坦組較正常組高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中藥組、厄貝沙坦組較模型組低(P＜0.05)，中藥組與厄貝沙坦之間無差別(P＞0.05)。12周與8周比較，Bax/Bcl-2在正常組(P＞0.05)、模型組(P＞0.05)無差別。中藥組和厄貝沙坦組的降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1益氣養(yǎng)陰活血中藥可以降低糖尿病腎病大鼠的血糖，總膽固醇，甘油三酯。
　　 2益

16、氣養(yǎng)陰活血中藥可以減少糖尿病腎病大鼠的尿蛋白，降低血尿素氮，提高肌酐清除率，保護(hù)腎功能。
　　 3益氣養(yǎng)陰活血中藥可以有效抑制糖尿病腎病大鼠的腎小球毛細(xì)血管基底膜的增厚、系膜基質(zhì)的增生，延緩腎臟病理的進(jìn)展。
　　 4益氣養(yǎng)陰活血中藥可以有效地上調(diào)bcl-2表達(dá)，降低bax表達(dá)，從而降低bax/bcl-2，減少腎組織的細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)的完整和功能的穩(wěn)定，且隨著療程的增加，這一作用趨勢(shì)可能更加顯著，為防治糖尿病腎病