沒藥倍半萜化合物抑制前列腺癌細胞增殖的作用機制研究.pdf

1、前列腺癌(prostate callcer，PCa)在歐美國家的發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第二位，在我國發(fā)病率相對較低，但近年來呈上升趨勢，位于泌尿系腫瘤的第3位。前列腺癌潛伏期長，惡性程度高，死亡率高，其發(fā)病機制及生物學特性復雜。研究證實，雄激素受體(Androgen receptor,AR)在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展、惡化轉(zhuǎn)移中起重要作用。AR屬于核受體家族，通過介導雄激素的作用，轉(zhuǎn)錄激活雄激素誘導基因(androgen-inducible

2、genes)的表達，從而影響前列腺的正常生長發(fā)育和維持前列腺的正常分泌功能。通常，AR定位在細胞胞質(zhì)區(qū)，與熱休克蛋白等形成多蛋白無活性的復合體。結(jié)合雄激素配體后，AR構(gòu)象改變，與熱休克蛋白解離、磷酸化成為活化的AR進入細胞核內(nèi)，其二聚體特異識別并結(jié)合在雄激素誘導基因調(diào)控區(qū)的雄激素應(yīng)答元件(androgen responsive elements，AREs)上，募集輔助調(diào)節(jié)因子(cofactors)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在前列腺中，上調(diào)前列

3、腺特異抗原(prostate-specific antigen，PSA)、人激肽釋放酶2(human glandularkallikrein，hk2)表達[2-4]。對前列腺癌而言，激素撤除療法是治療晚期前列腺癌的主要方法，但患者通常在治療一年左右后復發(fā)，前列腺癌不再對激素敏感，導致激素治療失敗、前列腺癌演變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔?hormone refractoryprostate cancers，HRPCs)。現(xiàn)已證實，AR的高表達

4、、基因突變產(chǎn)生的有功能的突變體以及AR的非激素依賴性激活、AR輔激活因子的過表達等造成的AR功能異?；罨菍е翽Ca發(fā)生、發(fā)展、惡化轉(zhuǎn)移、多藥耐藥的機理之一[5-6]，也是前列腺癌演變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔┑姆肿訖C制，其演變過程更為復雜，給臨床的早期診斷和治療帶來困難。目前，化療是治療HRPCs的主要手段，臨床上的治療藥物各有其作用特點，但效果不佳，因此尋找高效、靶向性強的抗前列腺癌藥物仍然是治療前列腺癌亟待解決的問題。其中降低AR的表

5、達、抑制其功能可能是很效治療靶點之一。 亞洲國家PCs的低發(fā)病率使科學家們對其飲食結(jié)構(gòu)產(chǎn)生興趣，研究證實，黃酮、多酚類化合物[10]被認為是預防治療PCs很有潛力的藥物。沒藥(myrrh)為臨床常用鎮(zhèn)痛中藥，目前從沒藥中已分離鑒定了300多個化合物，包括萜類、甾體、黃酮、木脂素等化學成分。最近的研究表明，沒藥倍半萜成分具有抗腫瘤活性，但其抗腫瘤的分子機制尚無深入研究。我們對分離得到的兩個吉瑪烷型倍半萜化合物(Germacrane

6、 sesquiterpenoids)，化合物1:1(10)E,2R,4R)-2-甲氧基-8,12-環(huán)氧吉瑪-1(10),7,11-三烯-6-酮(1(10)E,2R,4R)-2-methoxy-8，12-epoxygermacra-1(10),7,11-trien-6-one，簡稱ST1)，化合物2：2-甲氧基-5-乙?；?4-呋喃吉瑪-1(10)-烯-6-酮(2-methoxy-5-acetoxy-furanogermacr．-1(10

7、)-en-6-one，簡稱ST2)進行了抗腫瘤活性分析，其中對前列腺癌細胞的抑瘤活性較為突出，本文就該類化合物抑制前列腺癌細胞增殖的作用機制進行了初步探討。 通過細胞增殖實驗首先檢測ST化合物的抑瘤活性，結(jié)果顯示，ST在較高濃度時(80μmol/L)對大腸癌HT29細胞增殖有顯著的抑制作用，對前列腺癌激素依賴性細胞LNCaP、激素非依賴性PC3、PC3M、DU145細胞在濃度為40μmol/L，時均有明顯的抑瘤活性。通過利用肝正

8、常永生化細胞進行化合物毒性檢驗，結(jié)果表明ST1在濃度為80μmol/L時對正常細胞有抑制作用。進一步利用流式細胞術(shù)分析ST1化合物對前列腺癌LNCaP細胞的細胞周期變化及細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，兩個沒藥倍半萜化合物使S期細胞明顯減少，細胞主要停滯于G0/G1期，但沒有顯著的誘導凋亡作用。通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、蛋白印跡技術(shù)、細胞瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)分析細胞周期主要調(diào)控因子之-p21WAF/CIPI及G0/G1期調(diào)控蛋白c

9、yclinD的表達，結(jié)果表明，ST能在mRNA和蛋白水平誘導p21WAF/CIPI的表達，同時降低細胞周期蛋白cyclinD的表達，降低cyclinD啟動子的表達活性。從結(jié)果來看，化合物對p21WAF/CIPI及cyclinD的影響并不是非常顯者。 由于AR在前列腺癌LNCaP細胞的增殖中處于關(guān)鍵位置，ST化合物是否通過影響AR的表達和功能抑制前列腺癌細胞的增殖是我們需要進一步探討的問題。Westerm Blot結(jié)果顯示，雄激素

10、能非常顯著的誘導AR的表達，而ST1、ST2均能在雄激素存在的情況下顯著降低AR的表達、并減少AR向細胞核定位；熒光素酶活性分析表明，ST能抑制AR啟動子的表達活性；細胞免疫熒光結(jié)果也證實ST化合物對AR表達的抑制作用。抑制AR功能是抑制細胞增殖的關(guān)鍵所在，通過檢測PSA啟動子表達活性、以及檢測只含有hk2基因調(diào)控區(qū)中ARE元件的報告基因表達活性來研究AR的轉(zhuǎn)錄激活功能。結(jié)果表明，ST化合物能非常顯著的抑制PSA啟動子和hk2-ARE元

11、件報告基因的表達活性；另外PSA為分泌蛋白，通過檢測細胞培養(yǎng)液PSA的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，雄激素顯著增加PSA蛋白水平，而細胞經(jīng)ST化合物處理后，PSA蛋白水平顯著降低，表明化合物能顯著抑制AR的轉(zhuǎn)錄激活功能。另外，AR的輔助調(diào)節(jié)因子通過與AR蛋白間的相互作用直接影響AR的轉(zhuǎn)錄激活功能，我們通過免疫共沉淀檢測化合物對AR與AR輔助激活因子SRC-1和ARA70蛋白間相互作用的影響。結(jié)果顯示，激素顯著加強AR與SRC-1蛋白、ARA70蛋白間的