腦腫瘤干細胞體外分化研究.pdf

1、第一部分：腦腫瘤干細胞體外分化的形態(tài)、標(biāo)志物和細胞增殖動力學(xué)特征 目的探討腦腫瘤干細胞(braintumorstemcell,BTSC)在體外分化過程中的細胞形態(tài)、分化相關(guān)標(biāo)志物表達和增殖動力學(xué)變化，為進一步研究BTSC分化走向提供實驗依據(jù)。 方法取來自于臨床手術(shù)標(biāo)本(病理診斷為間變性室管膜瘤)的腫瘤干細胞球(原發(fā)和復(fù)發(fā))，用CDl33免疫磁珠分離出CD133+細胞，加血清分化，相差顯微鏡下觀察其形態(tài)，在未分化和分化后第

2、3、7、10、21天收集細胞，流式細胞術(shù)檢測細胞CD133、Nestin、dFAP、β-TubulinⅢ的表達。在未分化和分化第7天做增殖周期測定。取正常神經(jīng)干細胞(neuralstemcell，NSC)作為對照。 結(jié)果1)形態(tài)：BTSCs由圓形到短梭形和多角形、再到長梭形及少量星形，第7天以后細胞形態(tài)往短梭形和圓形回復(fù)，出現(xiàn)細胞聚集成球重新飄浮在培養(yǎng)基中；NSCs按固有規(guī)律分化：從圓形到多角形和梭形再到星形膠質(zhì)細胞和長纖維狀的

3、神經(jīng)元。2)標(biāo)志物：BTSCs和NSCs未分化時CDl33和Nestin均高表達，CDl33分別為84.12±1.22％和86.36±1.95％，Nestin分別為80.76±1.83％和78.79±1.67％；BTSCs分化后CDl33和Nestin全程表達，且先降后升，第7天表達率分別為3.65±0.17％和28.99±1.26％，第2l天分別為14.63±1.16％和45.46±1.27％；GFAP和β-TubulinⅢ表達量一直

4、偏低，但GFAP陽性表達率相對高于β-TubulinⅢ；NSCs在分化第十天時失去了CD133和Nestin的表達，GFAP和β-TubulinⅢ表達量明顯增加，分別為88.94±1.23％和11.94±0.36％。3)增殖周期及倍體：BTSCs分化前為亞二倍體，分化后有少量二倍體和大量亞二倍體及超二倍體，處于G2-M期和S期的細胞比例大于NSCs，復(fù)發(fā)BTSCs分化后細胞組成比原發(fā)BTSCs復(fù)雜；神經(jīng)干細胞分化前后都為整二倍體，主要處

5、于G0-G1期。 結(jié)論細胞形態(tài)、標(biāo)志物的表達、增殖周期及倍體變化反映出腦腫瘤干細胞分化走向和神經(jīng)干細胞不同，存在明顯的分化障礙。 第二部分：丙戊酸鈉對腦腫瘤干細胞誘導(dǎo)分化作用的體外實驗研究目的探索丙戊酸鈉對人腦腫瘤干細胞的誘導(dǎo)分化作用，觀察分化相關(guān)標(biāo)志物在分化過程中的表達。 方法用不同濃度(1.2mmol/L、2.4mmol/L)的丙戊酸鈉(valproate，VPA)在體外含血清和無血清條件下誘導(dǎo)人腦腫瘤干細胞

6、。誘導(dǎo)分化第7、21天收集細胞流式細胞儀檢測CD133、Nestin、GFAP、β．TubulinⅢ的表達率。誘導(dǎo)分化第10天測定細胞周期和倍體．誘導(dǎo)分化4小時和第10天做各相關(guān)特異性蛋白免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)和蛋白表達情況。 結(jié)果BTSC在含血清條件下培養(yǎng)，和未用VPA組相比，細胞生長受到抑制，GFAP、β．TubulinⅡ的表達率明顯升高，但是Nestin表達率沒有降低，且和CDl33一直存在，沒有呈現(xiàn)先降再

7、升的趨勢。細胞周期受到阻滯，G0/G1期細胞比例增加，G2/M期細胞比例減少，這種誘導(dǎo)作用沒有表現(xiàn)出明顯的藥物作用時間和作用濃度的依賴性。BTSC在無血清加生長因子條件下培養(yǎng)，和未用VPA組相比，細胞形成克隆球的能力沒有下降，特異性蛋白的表達率沒有明顯差異(P＞0.05)，均以Nestin為主，GFAP、B．TubulinⅢ的表達率非常低，細胞周期和倍體測定結(jié)果差異也不顯著(P＞0.05)。結(jié)論BTSC在含血清條件下培養(yǎng)，VPA對貼壁生