細胞因子GP46、bFGF、MMP9在大鼠肝纖維化分子發(fā)生機制中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、近年來，有關(guān)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)研究已經(jīng)取得了很大的進展，業(yè)已證明肝星狀細胞(HepaticStellateCells，HSCs)的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，活化的HSCs向肌成纖維細胞(Myofibroblast，MFB)轉(zhuǎn)型，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix，ECM)，沉積于肝組織，促進肝纖維化的形成，整個過程有一系列的細胞因子參與調(diào)控。 46KD膠原結(jié)合糖蛋白(A46-kDaco

2、llagenbindingglycoprotein，GP46)、堿性成纖維細胞因子(basicFibroblastGrowthFactor，bFGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase9，MMP9)是研究證實能在大鼠肝臟表達或與組織纖維化有關(guān)的幾個細胞因子，在不同的動物組織中觀察到這幾個因子之間似乎有內(nèi)在的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，但它們在肝纖維化形成過程中的具體作用、其間有無相互調(diào)節(jié)關(guān)系、它們和即刻早期基因ZF9是

3、否構(gòu)成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等均未見闡明。因此，深入研究這些問題對于進一步明確肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機理、篩選干預(yù)治療肝纖維化的理想靶點和理想模式有重要意義。 第一部分GP46、MMP9、bFGFmRNA和蛋白在正常及纖維化大鼠肝組織中的表達與分布的動態(tài)研究 目的：通過研究大鼠肝纖維化模型肝組織中GP46、bFGF、MMP9mRNA和蛋白水平的表達與分布規(guī)律，初步探討這三種蛋白在大鼠肝纖維化形成中的作用。 方法：皮下注射四

4、氯化碳和植物油混懸液誘導(dǎo)形成大鼠肝纖維化模型。通過免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR、Westernblot動態(tài)檢測不同時相纖維化大鼠肝組織中GP46、bFGF、MMP9的mRNA和蛋白表達和分布。同時通過V-G染色檢測肝組織纖維增生的程度和分布規(guī)律。 結(jié)果：隨著造模時間的延長，大鼠肝臟纖維逐漸增生，至8周末時已有明顯的纖維化和嚴重的肝細胞脂肪變性，增生的纖維在匯管區(qū)和中央靜脈及周圍組織出現(xiàn)得較早并且程度較重。GP46在大鼠纖維化肝

5、組織中的表達有逐漸增強的趨勢，主要分布在匯管區(qū)、中央靜脈附近和增生的纖維絲、纖維隔兩旁的組織以及血管壁中的間質(zhì)細胞和部分脂肪變嚴重的肝細胞胞漿中以及上述細胞分布區(qū)域的細胞外基質(zhì)。bFGFmRNA和蛋白水平的表達增強趨勢類似于GP46，主要分布在纖維隔附近的區(qū)域、Disse間隙以及匯管區(qū)和中央靜脈附近的間質(zhì)細胞和部分肝實質(zhì)細胞。細胞外亦可見片狀陽性區(qū)域，與陽性細胞分布規(guī)律大致相同。MMP9mRNA和蛋白表達較早即出現(xiàn)增強，至4周末時表達最

6、強，主要分布區(qū)域亦在匯管區(qū)和中央靜脈周圍組織，8周末時，表達下降，區(qū)域彌散。 結(jié)論：GP46的表達強度與四氯化碳所致的大鼠肝臟纖維組織增生在時間和空間上有著明顯的一致性，可能與大鼠肝纖維化密切相關(guān)。bFGF亦與四氯化碳所致的大鼠肝纖維化密切相關(guān)，它可能是肝纖維化的一種刺激因子。HSCs亦可能是bFGF的重要來源，bFGF可能是通過自分泌刺激和旁分泌刺激兩種途徑參與細胞外基質(zhì)代謝的。MMP9在肝纖維化進展過程中可能阻止肝纖維化進展

7、。 第二部分GP46、MMP9、bFGFmRNA和蛋白在正常及纖維化大鼠肝星狀細胞中表達與分布的動態(tài)研究 目的：通過研究大鼠肝纖維化模型肝組織分離培養(yǎng)的HSCs中GP46、bFGF、MMP9mRNA和蛋白水平的表達與分布規(guī)律，以進一步從細胞層面探討這三種蛋白參與肝纖維化形成的機理。 方法：四氯化碳肝纖維化模型的構(gòu)建同第一部分。每一組造模結(jié)束時通過膠原酶離體灌流消化法分離培養(yǎng)肝星狀細胞，RT-PCR和western

8、blot檢測HSCs中GP46、bFGF、MMP9基因mRNA和蛋白的表達。 結(jié)果：隨造模時間的延長，分離的HSCs表型逐漸向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變。HSCs中的GP46、bFGF和COLα2(I)mRNA和蛋白水平的表達均有逐漸遞增的趨勢。MMP9的表達則上升得更快，且4周時即達到高峰，8周時又有所回落。 結(jié)論：隨著造模時間的延長，HSCs逐漸活化，表型和數(shù)量均有改變。GP46在肝纖維化過程中的作用可能是通過HSCs達到的，

9、即GP46促進HSCs的活化，活化的HSCs又提高了GP46的生成，形成正反饋作用。HSCs能產(chǎn)生bFGF得到進一步證實，GP46和bFGF蛋白在肝纖維化進程中發(fā)揮促進作用的機理可能是通過自分泌和旁分泌兩種途徑參與細胞外基質(zhì)代謝。 第三部分大鼠肝纖維化形成中ZF9、GP46、bFGF以及ZF9、GP46、MMP9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究 目的：進一步闡明GP46、bFGF、MMP9在肝星狀細胞活化中的調(diào)節(jié)關(guān)系，了解ZF9、GP

10、46、bFGF以及ZF9、GP46、MMP9是否構(gòu)成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并在肝星狀細胞活化中起調(diào)節(jié)作用。 方法：在培養(yǎng)的肝星狀細胞株HSC-T6中轉(zhuǎn)染ZF9表達質(zhì)粒pcDNA3-ZF9以促進HSC-T6的活化，再分組共轉(zhuǎn)染GP46正義寡核苷酸和GP46反義寡核苷酸。RT-PCR檢測HSC-T6中的ZF9和GP46的mRNA表達，Westernblot檢測HSC-T6中的GP46、bFGF、MMP9、COLα2(I)蛋白的表達。

11、結(jié)果：轉(zhuǎn)染pcDNA3-ZF9顯著提高了ZF9、GP46和COLα2(I)的表達，并進一步提高bFGF和MMP9的表達，共轉(zhuǎn)染GP46反義寡核苷酸后GP46、bFGF、COLα2(I)下降至微弱表達，MMP9表達有下降但仍有一定量的表達。 結(jié)論：pcDNA3-ZF9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能使“靜止狀態(tài)”的HSC-T6表達ZF9，后者刺激GP46表達升高，又進一步刺激了bFGF和MMP9的表達，最終使COLα2(I)表達上調(diào)，阻滯了GP46的表

12、達就阻斷了這一信號級聯(lián)傳遞，ZF9、GP46、bFGF和ZF9、GP46、MMP9在大鼠肝纖維化過程中構(gòu)成了兩個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對膠原代謝起著不同的調(diào)節(jié)作用，其中GP46是一個關(guān)鍵細胞因子。阻斷GP46對肝纖維化有抑制作用，但作用并不完全。以GP46為靶標干預(yù)肝纖維化可能要結(jié)合干預(yù)GP46下游的其他細胞因子方可助良效。 第四部分中藥復(fù)方鱉甲軟肝片對大鼠肝纖維化的作用 目的：探討抗纖維化中藥復(fù)方鱉甲軟肝片抗肝纖維化的作用及其

13、與GP46基因的關(guān)系方法：四氯化碳/植物油混懸液(1：1，v/v)四肢內(nèi)側(cè)皮下注射制作大鼠肝纖維化模型，干預(yù)組用生理鹽水配制的鱉甲軟肝片灌胃，1粒/(只·次)，每天一次，連續(xù)8周。觀察肝組織的病理變化、血清肝酶譜(ALT、AST、AKP、γ-GT)的變化，放免法檢測PⅢP、Ⅳ型膠原、HA、LN的水平，RT-PCR檢測第八周造模組和干預(yù)組肝組織GP46mRNA水平。 結(jié)果：復(fù)方鱉甲軟肝片能明顯減輕大鼠纖維化肝組織的病理改變，降低血