ITS序列和β-香樹酯醇合成酶基因與甘草酸形成和積累的相關性研究.pdf

1、甘草酸含量是甘草質量的重要標志之一，但是不同種的甘草、不同季節(jié)收獲的甘草、不同產(chǎn)地的甘草、同一產(chǎn)地不同的甘草個體、甘草不同部位的甘草酸都存在含量差異，而且這種差異嚴重影響甘草藥材的臨床療效及其穩(wěn)定性；而且由于甘草酸含量的差異，導致對甘草種質資源的藥用價值評價難于進行。因此，揭示甘草酸形成和積累的機制，尋找和甘草酸形成和積累相關的分子標記對探討調控甘草藥材的質量，評價藥用甘草種質資源具有重要意義。 目前探討基因和活性成分相關性所選

2、擇的研究對象包括基因組和單個基因。以基因組如RAPD、AFLP等為研究對象，反映的是植物所有差異的總和，不能直接反映活性成分含量的變異。而且化學成分的差異可能是由有限的遺傳差異決定，基因組變異的聚類可能反映不出其變化；而以單個基因如matK基因、ITS序列等為研究對象，如果選定的基因非編碼基因，則只能反映它本身的分化，只有它和反映活性成分含量的基因同步進化時才能反映出活性成分含量的變異?；钚猿煞值墓δ芑虻亩鄳B(tài)性可能更能反應活性成分的變

3、化，但功能基因較長，作為直接選擇指標困難較大。為此，可通過通用基因進行間接選擇，或通過功能基因進行研究，尋找和活性成分含量變異密切相關的基因，為探討活性成分含量變異的基因機制奠定基礎。 為揭示甘草酸的形成機制，本文首先將實驗材料分成兩組：含甘草酸組和不含甘草酸組，通過比較兩組ITS序列和β-香樹酯醇合成酶基因第一外顯子(簡稱β-香樹酯醇合成酶基因)的序列差異，試圖揭示甘草酸形成(甘草酸的有無)和基因的相關性；然后根據(jù)不同甘草酸含

4、量，把實驗材料分成高甘草酸含量組和低甘草酸含量組，通過比較它們的ITS序列和β-香樹酯醇合成酶基因差異，揭示甘草酸積累和基因分化的相關性；本文還比較了甘草的不同器官的β-香樹酯醇合成酶基因的表達差異，揭示不同器官中甘草酸積累和基因表達的相關性。 主要結論如下：(1)基于ITS序列和5.8S基因序列差異劃分的基因型和甘草酸形成具有密切關系。根據(jù)ITS序列差異將甘草屬植物劃分成兩個基因型，TTCCTG基因型和ACTTGT基因型。其中

5、，TTCCTG基因型均形成甘草酸，ACTTGT基因型不形成甘草酸；根據(jù)5.8S序列也可將甘草屬植物劃分成A和G兩個基因型，其中，A基因型形成甘草酸，G基因型不形成甘草酸。 (2)黃甘草和脹果甘草、蜜腺甘草和光果甘草的ITS序列完全相同，支持黃甘草和脹果甘草合并，蜜腺甘草和光果甘草合并的分類處理，研究結果認為黃甘草和蜜腺甘草均可作為藥用甘草資源使用。 (3)不形成甘草酸并非由于β-香樹酯醇合成酶基因缺失的原因，因為甘草屬植

6、物中均具有β-香樹酯醇合成酶基因，根據(jù)其多態(tài)性，推測甘草屬植物形成甘草酸可能和β-香樹酯醇合成酶基因多態(tài)性有相關性。 (4)甘草不同種群(產(chǎn)地)的β-香樹酯醇合成酶基因存在豐富的多態(tài)性，在19份種質資源中共發(fā)現(xiàn)6個基因型，分別是Ⅰ型(TATGAGGT基因型)、Ⅱ型(TATGGGGT基因型)、Ⅲ型(CATGAGGT基因型)、Ⅳ型(TGTGGGGG基因型)、Ⅴ型(CATCACCT基因型)和Ⅵ型(CAACACGT基因型)。前3個基因型

7、占較大的比例(84％)，后3個基因型所占比例較小(16％)。其中，Ⅰ型(TATGAGGT基因型)和高含量甘草酸具有密切相關性。 不同種群(產(chǎn)地)的甘草藥材中甘草酸含量存在明顯差異，但它們之間的ITS序列完全相同，說明ITS序列不能反映甘草酸積累的變化。 (5)甘草β-香樹酯醇合成酶基因的分組和地理來源、傳統(tǒng)甘草藥材分類(東草和西草)有相關的趨勢，但關系不密切。暗示小環(huán)境在β-香樹酯醇合成酶基因多態(tài)性形成過程中起重要作用，

8、也說明同一產(chǎn)地甘草質量的差異可能具有相關性。 (6)β-香樹酯醇合成酶基因在甘草各部位中的表達時間存在差異，不定根表達β-香樹酯醇關鍵酶基因的時間最長，結合甘草不同部位的甘草酸含量測定結果，認為不同器官甘草酸含量差異和基因的表達時間具有密切關系。 本論文的創(chuàng)新之處如下：1.有人利用RAPD對甘草屬3種植物進行了研究，主要研究不同種的親緣關系或不同種群的親緣關系；本文對9種甘草屬植物的ITS序列多態(tài)性和甘草酸形成的相關性進

9、行了分析；系統(tǒng)研究了《中國植物志》承認的8種中的7種甘草的ITS序列，發(fā)現(xiàn)根據(jù)ITS序列多態(tài)性劃分的基因型和甘草酸的形成具有相關性；本文還利用ITS序列對黃甘草和蜜腺甘草進行了研究，支持黃甘草和蜜腺甘草做為藥用甘草基源使用。 2.有人克隆了光果甘草中β-香樹酯醇合成酶cDNA，本文在此基礎上研究4種甘草屬植物、19份甘草種質資源的β-香樹酯醇合成酶基因的多態(tài)性，將其多態(tài)性與甘草酸的形成和甘草酸含量變化結合起來，發(fā)現(xiàn)β-香樹酯醇合

10、成酶基因第一外顯子在甘草屬內和甘草種內均具有多態(tài)性，這種多態(tài)性和甘草酸的形成具有相關性，而且發(fā)現(xiàn)了一種基因型和高含量甘草酸具有密切的相關性，對甘草優(yōu)良品種的篩選具有指導意義。 3.有人對光果甘草種子發(fā)芽過程中、主根發(fā)育過程中β-香樹酯醇合成酶基因的表達情況進行了研究；本文對甘草不同部位的β-香樹酯醇合成酶基因表達情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)8月份只有不定根表達β-香樹酯醇合成酶基因，初步說明甘草不同部位甘草酸含量差異是由基因表達量差異決