宮頸癌紫杉醇聯(lián)合順鉑新輔助化療前后蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 采用雙向凝膠電泳（two-dimensional gelelectrophoresis，2-DE）結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)比較對(duì)紫杉醇（paclitaxel，T）聯(lián)合順鉑（cisplatin，P）新輔助化療作用敏感的宮頸癌組織化療前后蛋白質(zhì)組的差異，建立TP化療前后的宮頸癌2-DE圖譜，識(shí)別和鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，初步確定宮頸癌中與TP作用相關(guān)的蛋白質(zhì)，研究其作用機(jī)制，為改善宮頸癌患者TP新輔助化療療效、研制新的腫瘤靶向藥

2、物提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、選取6例宮頸痛住院病人，納入標(biāo)準(zhǔn)為：①化療前為局部晚期菜花型；②采用紫杉醇加順鉑新輔助化療：均化療1次，紫杉醇175mg/m2，順鉑60mg/m2；③化療10天后評(píng)價(jià)療效為顯效，腫瘤體積縮小50％以上；④約化療后15天行廣泛性子宮切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)；⑤術(shù)后病理診斷均為中分化鱗痛。宮頸癌組織化療前后標(biāo)本收集后立即-80℃保存。提取組織總蛋白，采用2-DE分離蛋白質(zhì)，經(jīng)考

3、馬斯亮藍(lán)染色、圖像掃描，得到化療前后的雙向電泳圖譜，采用PD-quest7.0軟件進(jìn)行匹配和差異分析，識(shí)別兩組之間表達(dá)差異蛋白點(diǎn)。從膠中切取表達(dá)差異明顯的蛋白點(diǎn)，用MALDI-TOF-TOF-MS方法進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲取質(zhì)譜圖，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定蛋白質(zhì)。
　　 2、根據(jù)獲得的差異蛋白的分類及抗體購(gòu)買的難易程度選擇4個(gè)差異表達(dá)蛋白，應(yīng)用Western Blot方法進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)其在以上6例宮頸癌組織標(biāo)本中化療前后的表達(dá)變化，觀察它們?cè)诨?/p>

4、療前后的表達(dá)是否與蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果一致。以蛋白質(zhì)組學(xué)所用提取的組織蛋白為研究對(duì)象，制備PAGE膠，測(cè)蛋白濃度后等量上樣，SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，抗體孵育，HRP-ECL，發(fā)光法顯色，膠片定影、掃描、分析。以GAPDH為內(nèi)參。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立了分辨率高、重復(fù)性好的宮頸癌化療前后的雙向凝膠電泳圖譜。化療前蛋白點(diǎn)598±64個(gè)，化療后蛋白點(diǎn)673±79個(gè)，組間平均匹配率為85.4％

5、。
　　 2、兩組間差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為102個(gè)，從中選擇表達(dá)差異明顯的13個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，全部鑒定成功，其中化療后與化療前相比，11個(gè)蛋白下調(diào)，2個(gè)蛋白上調(diào)。化療后表達(dá)下調(diào)的蛋白：輔肌動(dòng)蛋白α1（actinin alpha1）、核纖層蛋白B1（1amin B1）、真核翻譯延長(zhǎng)因子1γ（Eukaryotic translationelongation factot1 gamma）、烯醇化酶1（enolase1）、膜聯(lián)蛋白1（a

6、nnexinI）、上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白1（epithelial cell marker protein1）、醛縮酶A（aldolase A）、熱休克蛋白27（heat shock protein27）、丙酮酸激酶（Dvruvate kinase）、角蛋白Ⅱ型（cytokeratin typeⅡ）、熱休克蛋白70（heat shock protein70）；化療后表達(dá)上調(diào)的蛋白：載脂蛋白A1（apolipoprotein A-1）、膜聯(lián)蛋白V

7、（anr|exin V）。差異蛋白可歸納為3類：①細(xì)胞骨架蛋白：輔肌動(dòng)蛋白α1，核纖層蛋白B1，角蛋白Ⅱ型，膜聯(lián)蛋白Ⅰ，膜聯(lián)蛋白V；②糖酵解酶類：烯醇化酶1，醛縮酶A，丙酮酸激酶；⑧其它：真核翻譯延長(zhǎng)因子1γ，上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白1，熱休克蛋白27，熱休克蛋白70，載脂蛋白A1。
　　 3、選擇HSP70、HSP27、烯醇化酶1、醛縮酶A用Western blot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示這四種蛋白在化療前組中的表達(dá)高于化療后組。該結(jié)果

8、與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究通過(guò)提取宮頸癌化療前后的總蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向凝膠電泳，建立了宮頸癌紫杉醇聯(lián)合順鉑新輔助化療前后的凝膠電泳圖譜，并應(yīng)用PD-quest7.0軟件對(duì)獲取的凝膠圖像進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。表明TP能夠?qū)е氯藢m頸癌蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變。
　　 2、本研究應(yīng)用MALDI-TOF-TOF-MS方法分析部分差異表達(dá)明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，獲取肽質(zhì)量指紋圖譜，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出了

9、13個(gè)差異蛋白質(zhì)。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，涉及腫瘤細(xì)胞骨架蛋白、糖酵解活動(dòng)及分子伴侶等方面，揭示宮頸癌TP新輔助化療影響了多個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)，TP可能是通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)功能來(lái)起作用的。
　　 3、Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示HSP70、HSP27、烯醇化酶1、醛縮酶A在化療前組中的表達(dá)高于化療后組，與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致。這些蛋白可能是抗癌藥物靶點(diǎn)，下調(diào)其表達(dá)可能增加宮頸癌對(duì)TP的藥物敏感性，有望成為臨床治療新靶點(diǎn)，改