S100A12-RAGE途徑在免疫性冠狀動(dòng)脈損傷中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　 川崎病(Kawasaki disease,KD)是一種兒童常見的急性全身性中小動(dòng)脈血管炎,目前已成為許多國家青少年兒童獲得性心臟病的首要原因。川崎病的發(fā)生機(jī)制仍不明確,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)s100A12-RAGE途徑在血管相關(guān)的炎癥疾病中有重要作用,其在川崎病血管病變中的重要作用與機(jī)制有待于進(jìn)一步明確。烏司他丁作為一種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑,可以抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等,在不少疾病中發(fā)揮保護(hù)作用.
　　 目

2、的:
　　 通過馬血清誘導(dǎo)的仔豬冠狀動(dòng)脈損傷,建立免疫性血管炎模型;闡述s100A12-RAGE途徑在此免疫性冠狀動(dòng)脈損傷中的作用及機(jī)制;探討中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑烏司他丁、S100A12-RAGE途徑及馬血清誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈損傷之間的相互聯(lián)系,并評(píng)估此模型能否解釋川崎病的發(fā)生發(fā)展。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均采用純種長白豬,1.5-3月齡,健康清潔級(jí),雄性,體重9-12Kg。
　　 第一部分:馬血

3、清誘導(dǎo)仔豬“川流不息崎病樣”冠狀動(dòng)脈炎模型的建立
　　 11頭仔豬隨機(jī)分成四組,10ml/kg馬血清靜脈免疫動(dòng)物,間隔5天1次,共3次。將第一次注入血清的時(shí)間作為第0天,實(shí)驗(yàn)過程中觀察其臨床表現(xiàn),分別于實(shí)驗(yàn)的15天(5頭),20天(2頭),25天(2頭),30天(2頭),處死動(dòng)物,取新鮮帶心肌組織的冠狀動(dòng)脈標(biāo)本,中性福爾馬林固定,石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察冠狀動(dòng)脈病變情況。
　　 第二部分:烏司他丁、S100A12-

4、RAGE途徑及馬血清誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈病變間的作用研究
　　 1、動(dòng)物模型
　　 1)模型組(10頭):稱取體重后,常規(guī)固定,力月西(咪達(dá)唑侖注射液)0.1ml/kg生理鹽水稀釋后肌肉注射,麻醉起效后,馬血清(Gibco,蛋白含量53g/L)免疫仔豬,用10ml/kg馬血清靜脈注射,間隔5天注射1次,共3次.
　　 按時(shí)間順序分為三組,即實(shí)驗(yàn)第0天(自身正常對(duì)照),第10天(血清免疫完成時(shí),相當(dāng)于病程的第5天,急性期

5、)、20天(相當(dāng)于病程的第15天,亞急性期)。第20天組再分為兩組,烏司它丁組與陽性對(duì)照組。
　　 ①烏司他丁組(5頭):從馬血清免疫完成的第1天起(第11天),1萬U/kg烏司他丁,用生理鹽水稀釋至20ml,靜脈注射,每天1次×3天,共飼養(yǎng)20天。
　　 ②陽性對(duì)照組(5頭):從馬血清免疫完成的第1天起(第11天),生理鹽水20ml,靜脈注射,每天1次×3天,共飼養(yǎng)20天。
　　 2)正常對(duì)照組(2頭):與模型

6、組相同環(huán)境,相同飼養(yǎng)條件,不予任何干預(yù)措施(HE染色和免疫組化染色時(shí)作為對(duì)照).
　　 所有動(dòng)物于第0天,10天、20天靜脈抽血10ml,第20天時(shí)10％氯化鉀心內(nèi)注射,處死動(dòng)物。
　　 2、常規(guī)檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白,血小板、血清白蛋白、C反應(yīng)蛋白及紅細(xì)胞沉降率.
　　 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞上S100A12及RAGE的表達(dá)水平及熒光強(qiáng)度。
　　 4、組織石蠟切片、HE染色、S100A12及R

7、AGE免疫組化染色。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:馬血清誘導(dǎo)仔豬“川崎病樣”冠狀動(dòng)脈炎模型的建立
　　 1、病程中出現(xiàn)類似川崎病的臨床表現(xiàn):發(fā)熱(體溫上升期伴寒戰(zhàn))、全身多形性皮疹、口唇紅、眼睛紅等。
　　 2、大體肉眼觀:大體形態(tài)未見異常,冠狀動(dòng)脈及其主要分支未見串珠樣改變或明顯瘤樣擴(kuò)張現(xiàn)象。
　　 3、HE染色結(jié)果:馬血清免疫的仔豬15天組主要以心肌炎癥為主,血管病變不明顯;20天組冠狀動(dòng)脈

8、已有嚴(yán)重?fù)p傷,內(nèi)皮細(xì)胞浸潤,內(nèi)膜中斷,內(nèi)膜增厚,內(nèi)彈力纖維層破壞等表現(xiàn)均有存在;25天組,30天組損傷程度與第20天組無明顯差異。
　　 第二部分:烏司他丁、S100A12-RAGE途徑及馬血清誘導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈病變間的作用研究
　　 1、不同時(shí)間點(diǎn)血液學(xué)指標(biāo):第0天(正常對(duì)照組),第10天(免疫完成組),第20天(烏司他丁組),第20天(陽性對(duì)照組)各項(xiàng)指標(biāo)分別為白細(xì)胞(×109/L):16.74±6.27,24.35±7

9、.79,17.06±2.67,13.12±2.79;血紅蛋白(g/L):103.60±10.71,106.60±10.53,103.60±8.44,104.00±6.36;血小板(×109/L):1068.6±447.06,293.50±116.31,422.75±88.51,452.50±67.69;血清白蛋白(g/L):39.33±5.04,28.86±3.77,36.52±2.58,34.62±4.03;C反應(yīng)蛋白(g/L):均＜

10、1;紅細(xì)胞沉降率(mm/h):2.11±1.27,2.11±0.60,4.20±2.17,2.40±0.89.
　　 2、S100A12與RAGE在CECS的表達(dá):第0天(正常對(duì)照組),第10天(免疫完成組),第20天(烏司他丁組),第20天(陽性對(duì)照組)各項(xiàng)指標(biāo)分別為CECs/MNC(％):0.49±0.44,0.58±0.38,0.33±0.13,0.39±0.16;S100A12-CECs/CECs(％):87.61±8.

11、72,91.33±9.67,89.31±8.96,94.02±2.83;FI-S100A12-CECs:200.28±79.75,232.46±93.27,225.55±73.64,206.09±96.59;RAGE-CECs/CECs(％):96.16±10.42,82.60±15.57,68.75±17.77,62.73±31.58;FI-RAGE-CECs:264.38±210.31,122.98±76.16,185.25±103

12、.46,151.21±78.54。
　　 3、HE染色及S100A12、RAGE免疫組化結(jié)果:
　　 1)HE染色陽性對(duì)照組HE染色結(jié)果同模型建立時(shí)第20天的情況。烏司他丁的干預(yù)不能阻止冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮損傷,干預(yù)后皮疹處皮膚炎癥并未迅速消退。
　　 2)S100A12石蠟切片的免疫組化染色
　　 半定量計(jì)數(shù)法計(jì)算出每個(gè)視野S100A12陽性細(xì)胞的平均數(shù)目,烏司他丁組:8.61±2.76;陽性對(duì)照組:18.00

13、±22.03;正常對(duì)照組:9.46±5.64.陽性對(duì)照組炎性細(xì)胞浸潤的部位高表達(dá)S100A12陽性細(xì)胞,而血管內(nèi)皮細(xì)胞偶及S100A12細(xì)胞陽性表達(dá)。
　　 3)RAGE石蠟切片的免疫組化染色
　　 RAGE主要表達(dá)于胞漿內(nèi),如心肌組織細(xì)胞核未明顯染色,胞漿強(qiáng)染。RAGE在冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞的免疫反應(yīng)積分(IRS)分別為,烏司它丁組:11.11±1.76,0.78±0.67,5.56±2.13;陽性對(duì)

14、照組:12.00±0.00,2.70±3.34,7.60±1.27;正常對(duì)照組:6.50±3.54,1.50±0.71,3.50±3.54。
　　 結(jié)論:
　　 1、S100A12-RAGE途徑參與馬血清誘導(dǎo)的免疫性冠狀動(dòng)脈損傷過程,S100A12對(duì)血管內(nèi)皮的攻擊可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落,內(nèi)皮損傷的直接原因。
　　 2、免疫性血管炎狀態(tài)下,循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞及組織上S100A12及RAGE的表達(dá)隨著病情發(fā)展而發(fā)生變化,二