反式桂皮醛對髓細胞白血病細胞體外效應的研究.pdf

1、第一部分、反式桂皮醛對急性髓細胞白血病細胞增殖和凋亡的影響。 目的：研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對急性髓細胞白血?。╝cutemyeloid leukemia，AML）細胞增殖和凋亡的影響。 方法：用不同濃度的TCA和/或阿糖胞苷（β-D-Arabinofuranosyl cytosine，AraC）處理AML細胞株HL60 或AML初治患者及健康人骨髓單個核細胞（bone marr

2、owmononuclear cell，BMMNC）。CCK-8法測定HL60細胞增殖活性，流式細胞術檢測HL60細胞周期變化，Annexin V/PI雙標法檢測HL60細胞和BMMNC凋亡，CD45/CD34/Annexin V三標法檢測BMMNC CD34+細胞凋亡。Western blot檢測TCA處理后HL60細胞c-myc基因表達。激光共聚焦術檢測TCA處理后HL60細胞NF-κB活性。甲基纖維素法檢測TCA處理后BMMNC克隆

3、形成。 結論：TCA通過使NF-κB失活，下調原癌基因c-myc的表達，使HL60細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡，發(fā)揮抗白血病效應。TCA對AML BMMNC和CD34+細胞也產生明顯的凋亡誘導效應，并能協(xié)同AraC發(fā)揮抗白血病效應，對正常BMMNC的細胞毒作用很小。 第二部分、反式桂皮醛對慢性髓細胞白血病細胞增殖和凋亡的影響。 目的：研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對慢性髓細胞白血

4、病（chronicmyeloid leukemia，CML）細胞增殖和凋亡的影響。 方法：用不同濃度的TCA處理CML細胞株K562和初治CML患者及健康人骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cell，BMMNC）。CCK-8法測定K562細胞增殖活性，流式細胞術檢測K562細胞周期變化、K562細胞和BMMNC凋亡及K562細胞膜電位和Fas抗原表達。Western blot檢測K562細胞c-my

5、c基因表達和Crkl蛋白磷酸化水平。Real time PCR檢測K562細胞Bcr-Abl mRNA表達。甲基纖維素法檢測CMLBMMNC克隆形成。 結論：低濃度TCA（≤30 μM）早期可能促進K562細胞增殖，而后期可誘導細胞周期阻滯，從而抑制K562細胞生長。中濃度TCA（60 μM）早期阻滯細胞周期于G2 /M期，而隨作用時間延長，誘導細胞出現凋亡。高濃度TCA（≥90 μM）則通過誘導細胞凋亡，從而抑制K562細胞的

6、生長，凋亡率呈時間和劑量依賴性。兩條主要的凋亡通路，即線粒體介導和Fas介導的凋亡通路，都參與了TCA誘導的凋亡。TCA可能通過抑制Bcr-Abl轉錄，從而減少Bcr-Abl蛋白產物，削弱酪氨酸激酶效應，下調c-myc癌基因的蛋白表達，導致CML細胞凋亡、抑制CML細胞增殖。以上提示TCA具有明顯的抗慢性髓細胞白血病效應，對正常骨髓單個核細胞的細胞毒作用很小，是一個很有應用前景的藥。 第三部分、反式桂皮醛誘導髓細胞白血病細胞分化

7、。 目的：本部分旨在研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對髓細胞白血病細胞分化的影響及機制。 方法：用TCA和/或反式維甲酸（all-trans-Retinoic acid，ATRA）處理髓細胞白血病細胞株HL60細胞及K562細胞。相差顯微鏡和Wright’s-Gimsa染色觀察細胞形態(tài)變化。流式細胞術檢測細胞分化抗原表達、細胞周期和凋亡。Western blot檢測HL60細胞c-myc

8、基因和p27基因表達、K562細胞c-myc基因表達和Crkl蛋白磷酸化水平。激光共聚焦術檢測HL60細胞p16基因和Cdc6基因表達變化。 結論：TCA（≤60 μM）可誘導髓細胞白血病細胞分化，但不同種類的細胞對TCA的反應有差異性，而且同種白血病細胞對不同濃度的TCA的反應不同。TCA 誘導HL60白血病細胞分化與c-myc蛋白水平下降和p27蛋白水平上調有關，p16基因和Cdc6基因參與TCA誘導的HL60細胞分化過程。

9、TCA可增強ATRA對HL60細胞的誘導分化效應。TCA誘導K562細胞的分化與c-myc和Crkl蛋白磷酸化水平下降有關。 第四部分、反式桂皮醛對急性髓細胞白血病細胞粘附和遷移的影響。 目的：本部分旨在研究反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）細胞粘附和遷移的影響。 方法：TCA處理AML細胞株HL60細胞，流式檢

10、測細胞表面CXCR4的表達。Transwell法檢測不同濃度TCA對重組基質細胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）誘導的HL60遷移和浸潤的影響。羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE）標記HL60細胞，共聚焦顯微鏡和流式細胞術檢測HL60細胞染色情況。CFSE標記的HL60細胞與AML骨髓基質細胞（b

11、one marrow stromal cell，BMSC）共培養(yǎng)，用共聚焦檢測不同濃度TCA處理后HL60細胞與AML BMSC的粘附情況。ELISA法檢測TCA對AML BMSC分泌SDF-1α的影響。相差顯微鏡觀察TCA處理后AML BMSC細胞形態(tài)變化，流式細胞術檢測AMLBMSC細胞凋亡。 結論：TCA除可直接抑制白血病細胞的增殖、誘導白血病細胞凋亡和分化外，還可能通過下調白血病細胞CXCR4表達、抑制骨髓基質細胞SDF

12、-1分泌和誘導骨髓基質細胞凋亡、抑制白血病細胞對骨髓基質細胞的趨化，使白血病細胞一方面失去基質層的支持，另一方面易于發(fā)生凋亡，因此有可能削弱骨髓基質細胞對白血病細胞潛在的保護作用，有利于清除髓內白血病細胞。 第五部分、反式桂皮醛調節(jié)髓細胞白血病細胞mel18基因表達。 目的：本研究旨在檢測mel18基因在急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的表達，研究mel18基因對AML細胞的增殖、

13、凋亡和周期的影響，探討反式桂皮醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）對AML細胞mel18基因的調控。 方法：運用逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測白血病細胞株mel18 mRNA表達，生物素-生物素-過氧化物酶（avidin-biotin-peroxidase complex，ABC）法免疫組織化學（immun

14、ohistochemistrystain，IHC）染色分析髓細胞白血病細胞株、初治AML患者骨髓單個核細胞和健康人外周血及骨髓單個核細胞的Mel18蛋白表達。運用十四酰佛波乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetaet，PMA）誘導HL60細胞分化，流式細胞術、免疫組化法和激光共聚焦術檢測誘導分化細胞的Mel18蛋白表達變化。通過基因重組和分子克隆技術構建pLenti6/V5-mel18真核表達載體并鑒定，應用脂

15、質體（Lipofectamine2000）轉染，將pLenti6/V5-mel18和pLenti6/V5-LacZ（陰性對照）導入HL60和U937細胞。RT-PCR和流式細胞術檢測pLenti6/V5-mel18質粒轉染細胞中mel8基因的表達。用CCK-8法測定細胞增殖活性，流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期。TCA誘導K562細胞和HL60細胞分化，流式細胞術和激光共聚焦術檢測Mel18蛋白表達。 結論：mel18基因在AM