hPOT1在胃癌中的異常表達(dá)及其對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用.pdf

1、胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，它的發(fā)生是由多基因改變、多種因素參與、并經(jīng)歷了多步驟的漸進(jìn)過(guò)程，癌基因、抑癌基因、DNA錯(cuò)配修復(fù)基因、細(xì)胞黏附分子、端粒/端粒酶、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和生長(zhǎng)因子/受體系統(tǒng)等多個(gè)基因改變的積累參與了由正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胃癌的過(guò)程。端粒保護(hù)蛋白(protectionoftelomeres，POTl)是美國(guó)科學(xué)家PeterBaumann等人于2001年在人和裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的一種端粒單鏈結(jié)合蛋白，近年來(lái)的研究表明，它

2、對(duì)于端粒長(zhǎng)度的調(diào)控以及染色體的穩(wěn)定有著非常重要的作用，其表達(dá)水平下降或者功能異常會(huì)引起端粒功能的降低以及染色體畸變，與人類細(xì)胞的老化和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。為進(jìn)一步研究人端粒保護(hù)蛋白(humanprotectionoftelomeres，hPOT1)在胃癌中表達(dá)水平的變化及其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們采用免疫組織化學(xué)染色的方法對(duì)57例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本和10例正常胃粘膜標(biāo)本中hPOT1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，通過(guò)正、反義基因轉(zhuǎn)染

3、技術(shù)，觀察了hPOT1蛋白表達(dá)水平的變化對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中hPOT1的表達(dá)水平明顯增高，降低胃癌細(xì)胞中hPOT1的表達(dá)水平，可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，為進(jìn)一步研究hPOT1的生物學(xué)功能及其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [目的]：研究hPOT1蛋白在胃癌中的表達(dá)水平及其臨床意義，觀察hPOT1蛋白表達(dá)水平變化對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響，希圖進(jìn)一步提示hPOT1蛋白與胃癌

4、發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。 [方法]： 1)采用SP免疫組化方法檢測(cè)hPOT1在57例胃癌標(biāo)本中的表達(dá)，同時(shí)以10例正常胃粘膜標(biāo)本做對(duì)照； 2)采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建hPOT1基因的正、反義真核表達(dá)載體，并經(jīng)過(guò)PCR、酶切、測(cè)序鑒定； 3)采用新一代聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectAMINTM2000作為載體，將hPOT1基因的正、反義真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入人胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)，以轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做對(duì)照，經(jīng)

5、G418篩選形成細(xì)胞克?。?4)采用PCR擴(kuò)增外源性NeoR基因的方法鑒定外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)； 5)采用Westernblot測(cè)定hPOTl蛋白的表達(dá)變化； 6)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線； 7)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期； 8)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡； 9)采用電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變； [結(jié)果]： 1)57例胃癌標(biāo)本的表達(dá)全陽(yáng)性，陽(yáng)性率100％，顯著高

6、于正常胃粘膜hPOTl的表達(dá)(40％)。浸潤(rùn)至或超過(guò)漿膜層的胃癌hPOTl表達(dá)強(qiáng)度顯著高于未達(dá)漿膜層者，Ⅲ/Ⅳ胃癌明顯高于I/II期胃癌，低分化胃癌高于高分化胃癌(P＜0.05)。 2)PCR、酶譜分析及DNA測(cè)序結(jié)果表明hPOTl正、反義真核表達(dá)載體序列和方向正確，并分別命名為pcDNA-s-hPOT1和pcDNA-as-hPOT1； 3)通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法，分別將hPOT1的正義基因真核表達(dá)載體(pcDNA-

7、s-hPOT1)、反義核酸真核表達(dá)載體(pcDNA-as-hPOT1)、空載體轉(zhuǎn)入SGC7901胃癌細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得細(xì)胞陽(yáng)性克隆，分別命名為SGC7901s，SGC7901as，SGC7901neo： 4)具有G418抗性的SGC7901s、SGC7901as、SGC7901neo細(xì)胞均能擴(kuò)增產(chǎn)生276bpNeoR基因片段，而SGC7901細(xì)胞擴(kuò)增陰性； 5)與SGC7901、SGC7901neo和SGC790

8、1s細(xì)胞相比，SGC7901as細(xì)胞hPOT1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，，細(xì)胞增殖速度減慢； 6)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，與SGC7901、SGC7901neo和SGC7901s細(xì)胞相比，SGC7901as細(xì)胞S期細(xì)胞明顯減少，G2/M期細(xì)胞增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加(15.28±0.8％vs1.84±1.3％，1.93±1.6％，1.75±0.6％，P＜0.05)，而SGC7901s、SGC7901neo細(xì)胞與SGC79

9、01細(xì)胞相比變化不大； 7)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染hPOT1反義基因的細(xì)胞SGC7901as出現(xiàn)凋亡改變，電子密度變深，胞漿濃縮，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃集成團(tuán)，染色體邊集成塊狀或環(huán)狀； [結(jié)論]：本研究發(fā)現(xiàn)hPOT1在胃癌組織中表達(dá)異常增高，并與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度及TNM分期密切相關(guān)。同時(shí)成功地構(gòu)建了hPOT1基因正反義真核表達(dá)載體，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人胃癌SGC7901細(xì)胞中，證明hPOT1反義真核表達(dá)載體可降低細(xì)胞hP