重組葡激酶-水蛭素融合蛋白工程菌的高密度發(fā)酵及其表達(dá)產(chǎn)物的分離純化、二聚體分析及與凝血酶相互作用的研究.pdf

1、目的：溶栓與抗凝藥物聯(lián)合療法是當(dāng)前血栓相關(guān)性疾病的重要臨床治療方案。重組SFH是葡激酶(SAK)和水蛭素(HV)通過(guò)一個(gè)Xa因子連接起來(lái)的融合蛋白，編碼該融合蛋白的重組基因插入溫控型表達(dá)載體pBV220，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選出大腸桿菌工程菌株用來(lái)大量生產(chǎn)SFH。通過(guò)體內(nèi)和體外藥效學(xué)試驗(yàn)證明，融合蛋白SFH有著良好的溶栓和抗凝雙功能，出血傾向大為降低，且有一定的血栓靶向性，效果優(yōu)于SAK和HV聯(lián)合用藥，因而有著廣泛的應(yīng)用前景。但是SF

2、H大腸桿菌工程株在低密度發(fā)酵的情況下，目的蛋白產(chǎn)量不到100mg/L，不能滿足臨床溶栓治療大量用藥的要求，而成為推廣應(yīng)用的瓶頸。因而通過(guò)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵來(lái)提高單位體積的目的蛋白產(chǎn)率也就成為大規(guī)模生產(chǎn)融合蛋白SFH的當(dāng)務(wù)之急。 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化是一個(gè)藥物蛋白生產(chǎn)中比較棘手的問(wèn)題，由于每種蛋白的性質(zhì)不一樣，如等電點(diǎn)、分子量大小、疏水性、極性、親和性等，所以相應(yīng)的分離純化工藝也就不一樣，需要反復(fù)的實(shí)驗(yàn)與探索。 已知H

3、V存在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：與凝血酶相互作用的C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域和N端的催化結(jié)構(gòu)域。發(fā)色底物(S-2251)法實(shí)驗(yàn)說(shuō)明融合蛋白SFH失去了抗凝活性，即在水蛭素N端連接的SAK封閉了HV的N端的催化結(jié)構(gòu)域，但可能仍保留有C端的與凝血酶結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能，這是融合蛋白血栓靶向功能的基礎(chǔ)。 方法與結(jié)果：通過(guò)結(jié)合前人的研究經(jīng)驗(yàn)，采用易于控制的溶氧反饋的分批補(bǔ)料的培養(yǎng)方法高密度發(fā)酵重組大腸桿菌BL21(DE3)生產(chǎn)SFH融合蛋白。通過(guò)搖瓶培養(yǎng)對(duì)菌種和

4、pH的篩選，采用溶氧反饋的流加補(bǔ)料策略，進(jìn)行了5L發(fā)酵罐的合成培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基的發(fā)酵工藝的研究。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化，重組葡激酶一水蛭素融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)里得到了高效表達(dá)，菌體密度最終達(dá)到80OD600左右，菌體濕重達(dá)到115g/L以上，可溶性重組融合蛋白占菌體總蛋白的30％以上，含量約為1.2-1.3g/L，較優(yōu)化前的目的蛋白表達(dá)量提高了10倍以上。5L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝參數(shù)在40L發(fā)酵罐中進(jìn)行了放大培養(yǎng)，結(jié)果表

5、明該工藝能有效的放大，可適用于工業(yè)生產(chǎn)。 本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)發(fā)酵后菌體的反復(fù)凍融提取目的蛋白，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)后，選擇采用離子交換和凝膠過(guò)濾層析對(duì)融合蛋白進(jìn)行了分離純化，純化后回收的目的蛋白占總蛋白的20％，5L發(fā)酵罐發(fā)酵可獲得純品約720mg/L。經(jīng)反相高效液相色譜(RP-HPLC)和變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)后，蛋白純度達(dá)到98％以上。 在融合蛋白純化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了融合蛋白的同源二聚體，而且在溶液中還存在可

6、逆的蛋白自我二聚化的行為，經(jīng)疏水色譜(HIC)、高效排阻色譜(HPSEC)和MALDI-TOF分析，證明了二聚體的存在和可逆的自我交聯(lián)行為。蛋白同源二聚體的形成大部分原因是由于疏水作用和靜電相互作用的結(jié)果，同時(shí)與鹽濃度、溫度、pH等都有關(guān)系，本試驗(yàn)中利用HPSEC和HIC對(duì)其可能的形成原因進(jìn)行了分析，認(rèn)為SFH同源二聚化大部分原因系疏水相互作用所致。 由于該二聚體的存在能導(dǎo)致融合蛋白純化得率的降低和臨床使用過(guò)程中免疫源性的增加以

7、及藥品報(bào)批過(guò)程中質(zhì)檢方面的問(wèn)題，所以對(duì)溶液中同源二聚體的形成必須加以控制。甘露醇是通常用來(lái)在藥物保存過(guò)程中作為一種賦形劑和表面活性劑的小分子物質(zhì)，在本試驗(yàn)中意外的發(fā)現(xiàn)它能有效的阻止同源二聚體的生成，這可能與自由基的消除有關(guān)，至于具體的原因，尚有待進(jìn)一步的研究。 本文利用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)方法體外檢測(cè)了融合蛋白SFH和凝血酶的相互作用，并存在一定的劑量關(guān)系，證明了融合蛋白SFH和凝血酶的相互作用，表明該融合蛋白在體內(nèi)可