EPCAM抗原負(fù)載DC誘導(dǎo)腺癌特異性免疫殺傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:細(xì)胞免疫治療作為一種新的腫瘤治療方法，已成為繼手術(shù)、化療、放療后的第四大腫瘤治療方法。過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療即應(yīng)用患者的自身的免疫細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后，繼而再回輸給患者，對(duì)自體腫瘤進(jìn)行特異性殺傷，是一種全身性的腫瘤治療方法，具有副作用小，殺傷效率高，對(duì)靜止期細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞都有殺傷功能，且可產(chǎn)生長(zhǎng)久免役記憶。臨床上應(yīng)用的免疫細(xì)胞主要是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)及全抗原負(fù)載的混合免疫細(xì)胞，但還不能達(dá)到對(duì)腫瘤殺傷更高的期望，本

2、實(shí)驗(yàn)通過(guò)特異性抗原EPCAM負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)混合免疫細(xì)胞（EP-effector）與CIK及腫瘤全抗原負(fù)載DC誘導(dǎo)混合免疫細(xì)胞（Co-effeetor）對(duì)腺癌特異性免疫殺傷的對(duì)比研究，來(lái)證實(shí)特異性抗原EPCAM負(fù)載DC誘導(dǎo)腺癌特異性免疫殺傷效率是否更高？
　　方法:1體外培養(yǎng)兩種腺癌細(xì)胞株，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Colo205、LS-174腺癌細(xì)胞株表面EPCAM表達(dá);2通過(guò)梯度密度離心法分離健康成人外周血，收集單個(gè)核細(xì)胞(PB

3、MCs)，采用貼壁法分離出淋巴細(xì)胞及imDCs。并且體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CIK細(xì)胞并擴(kuò)增;3 Colo205裂解物的制備，分別將Colo205裂解物及特異性抗原EPCAM在第5天加入DC細(xì)胞中，負(fù)載imDCs，促進(jìn)其成熟，制備成成Colo205細(xì)胞裂解物成熟DC(Co-mDCs)及特異性抗原EPCAM成熟DC(EP-mDCs)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞在加入抗原前后其免疫表型變化并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分。4Co-mDCs與EP-mDCs與

4、CIK細(xì)胞體外共培養(yǎng)，第7天將兩種DC分別與CIK共培養(yǎng)，通過(guò)DC細(xì)胞CIK可獲得腫瘤全抗原及特異性抗原EPCAM的相關(guān)信息，使得部分CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有特異性殺傷活性的CTL，從而制備成DC-CIK-CTL混合免疫細(xì)胞Co-effector及EP-effector。5培養(yǎng)對(duì)數(shù)期腺癌細(xì)胞Colo205，按104/孔分別將100μl Colo205腺癌細(xì)胞加入96孔板中，按效靶比E∶T∶5∶1、10∶1、20∶1分別加入CIK、Co-ef

5、fector及EP-effector與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)單一靶細(xì)胞組、單一效應(yīng)細(xì)胞組及空白對(duì)照組，每實(shí)驗(yàn)組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃，5％ CO2保濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)后，加入CCK-820ul/孔，培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定各組吸A值。根據(jù)公式殺傷率(％)=1-(實(shí)驗(yàn)組A值-單純效應(yīng)細(xì)胞組A值）/單純靶細(xì)胞A值×100％，計(jì)算出效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1 Col

6、o205及LS174-T細(xì)胞EPCAM抗原表達(dá)量分別為99.73％、99.61％。
　　2 DC細(xì)胞在培養(yǎng)第5天，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)水平分別為11.9％、16.1、16.1％、28.1％，呈現(xiàn)相對(duì)低水平，提示DC細(xì)胞處于未成熟狀態(tài)，具有較強(qiáng)的遷移能力及攝取能力;于第5天分別加入腫瘤全抗原及EPCAM抗原培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)水平分別

7、為41.1％、66.3％、79.3％、83％及41.7％、69.6％、78.9％、85.7％，與未成熟DC細(xì)胞表面分子表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); DC細(xì)胞在加入抗原前后細(xì)胞表面分子從低表達(dá)到高表達(dá)，說(shuō)明DC細(xì)胞已經(jīng)成熟，具有抗原提呈能力。
　　3 CIK、Co-effector及EP-effector均可以殺傷腫瘤細(xì)胞，在效靶比E∶T分別為5∶1、10∶1、20∶1時(shí)，CIK效應(yīng)細(xì)胞的殺傷率(％)分別為:40.54±2.7

8、1、49.27±3.57、67.04±5.20; Co-effector效應(yīng)細(xì)胞的殺傷率(％)分別為:54.13±3.83、66.40±4.58、75.65±5.37; EP-effector效應(yīng)細(xì)胞的殺傷率(％)分別為:60.51±4.54、75.17±6.10、92.53±8.87。在組內(nèi)三者隨著效靶比的增加，殺傷率逐漸增大;在效靶比靶比E∶T20∶1條件下，CIK殺傷率比Co-effector、EP-effector低，相互之間有