PI3K在L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 PI3K在L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究
　　目的：研究PI3K在L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，探討其對(duì)細(xì)胞骨架的影響。
　　方法：（1）將培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞，分為對(duì)照組（Control組）、實(shí)驗(yàn)組（交聯(lián)干預(yù)組）。Control組為靜止?fàn)顟B(tài)細(xì)胞，即L-S與DREG56非交聯(lián)組（0min組）；實(shí)驗(yàn)組按交聯(lián)作用時(shí)間3min、5min、10min分成三個(gè)亞組。檢測(cè)對(duì)照組和交聯(lián)

2、3、5、10min后細(xì)胞內(nèi)的PI3K蛋白含量和磷酸化水平。
　?。?）將培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞，分為對(duì)照組（靜止細(xì)胞）、交聯(lián)組（L-S與DREG56交聯(lián)細(xì)胞）和干預(yù)組（交聯(lián)前使用PI3K的特異性抑制劑LY294002干預(yù)細(xì)胞）三組，通過(guò)免疫熒光強(qiáng)度檢測(cè)三組細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白（F-actin）聚合情況。
　　結(jié)果：（1）①PI3K蛋白水平：DREG56與L-S交聯(lián)3 min、5 min、10min后， PI3K的蛋白含量在3min

3、時(shí)明顯升高，與對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.01）；5min和10min時(shí)PI3K的蛋白含量明顯下降，與3min相比有顯著差異（P＜0.01），與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。②PI3K磷酸化水平：DREG56與L-S交聯(lián)3 min、5 min、10 min后，PI3K的磷酸化水平在3min、5min時(shí)都有升高，且3min時(shí)升高更明顯，兩組與對(duì)照組相比差異有顯著意義（P＜0.01，P＜0.05）；在10min時(shí)PI

4、3K的磷酸化水平下降，與對(duì)照組、3min及5min組比較有顯著差異（P＜0.01）。
　?。?）使用倒置熒光顯微鏡觀察對(duì)照組、交聯(lián)組和干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)F-actin平均熒光強(qiáng)度，交聯(lián)組的平均熒光強(qiáng)度明顯大于對(duì)照組和干預(yù)組，與對(duì)照組、干預(yù)組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；對(duì)照組與干預(yù)組比較無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：(1)L-選擇素與其單克隆抗體DREG56交聯(lián)誘導(dǎo)PI3K活化。
　　(2)活

5、化后的PI3K可以調(diào)控細(xì)胞骨架變化。
　　第二部分 PI3K與ZAP70在L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)系的研究
　　目的：在PI3K介導(dǎo)的L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中，Zap70是否為PI3K的上游信號(hào)分子。
　　方法：（1）將培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞分為對(duì)照組（Control組）、實(shí)驗(yàn)組（交聯(lián)干預(yù)組）。Control組為靜止?fàn)顟B(tài)細(xì)胞，即L-S與DREG56非交聯(lián)組（0min組）；實(shí)驗(yàn)組按交聯(lián)作用時(shí)間3min、5min、10min

6、分成三個(gè)亞組，檢測(cè)對(duì)照組和交聯(lián)3min、5min、10min后細(xì)胞內(nèi)的ZAP70蛋白含量和磷酸化水平。
　?。?）將培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞，分為PI3K組和ZAP70組。PI3K組：DREG56與L-S交聯(lián)前，用ZAP70的特異性抑制劑Piceatannol與Jurkat細(xì)胞孵育30分鐘，之后DREG56與L-S交聯(lián)3分鐘檢測(cè)PI3K蛋白含量和磷酸化水平；ZAP70組：DREG56與L-S交聯(lián)前，用PI3K的特異性抑制劑LY294

7、002與Jurkat細(xì)胞孵育30分鐘，之后DREG56與L-S交聯(lián)3分鐘檢測(cè)ZAP70蛋白含量和磷酸化水平。
　　結(jié)果：（1）①ZAP70蛋白水平：DREG56與L-S交聯(lián)3 min、5 min、10min后， ZAP70的蛋白含量在3min、5min、10min時(shí)均有升高且3min時(shí)達(dá)峰值，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05）。②ZAP70磷酸化水平：DREG56與L-S交聯(lián)3 min、5 min、10 min后，Z

8、AP70的磷酸化水平在3min、5min時(shí)升高且3min時(shí)升高更明顯，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；在10min時(shí)ZAP70磷酸化水平顯著下降，與對(duì)照組、3min及5min組比較有顯著差異（P＜0.01）。
　　（2）①DREG56與L-S交聯(lián)前，用ZAP70的特異性抑制劑Piceatannol與Jurkat細(xì)胞孵育30分鐘，之后DREG56與L-S交聯(lián)3分鐘檢測(cè)PI3K蛋白含量和磷酸化水平：PI3K蛋白含量與對(duì)照組比較無(wú)差

9、異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；PI3K磷酸化水平與對(duì)照組比較顯著降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。②DREG56與L-S交聯(lián)前，用PI3K的特異性抑制劑LY294002與Jurkat細(xì)胞孵育30分鐘，之后DREG56與L-S交聯(lián)3分鐘檢測(cè)ZAP70蛋白含量和磷酸化水平：ZAP70蛋白含量和磷酸化水平與對(duì)照組比較都有顯著降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　　結(jié)論：PI3K可能在L-選擇素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中是ZAP70的