種雞場大腸桿菌噬菌體的分析與臨床應(yīng)用.pdf

1、遏制細菌耐藥性行動計劃(2016-2020)是全民的共識與國家的意志的體現(xiàn)，需要實施切實的技術(shù)措施。除了依據(jù)可靠的藥敏試驗結(jié)果精準用藥外，噬菌體以其特異性強、與抗生素?zé)o交叉抗藥性、無殘留、對人畜無感染性、容易篩選獲得等獨特優(yōu)勢成為潛力巨大的選項。本文從山東省種雞場、商品雞場采集病料和糞樣篩選大腸桿菌的流行菌株，完善藥敏試驗方法，預(yù)警抗藥性菌株;篩選裂解性噬菌體，分析其生物學(xué)性質(zhì)和基因結(jié)構(gòu)，通過注射、口服方式進行治療試驗，以期控制種雞場致

2、病性大腸桿菌的感染和流行。
　　使用麥康凱培養(yǎng)基從臨床樣品和糞樣中篩選出疑似大腸桿菌，經(jīng)大腸桿菌特異性引物phoA共鑒定出大腸桿菌株117株。多位點序列分型(multilocussequencetyping，MLST)結(jié)果表明共有65個ST型，其中ST155、ST156與ST69居多，另發(fā)現(xiàn)兩個新ST型。
　　線性梯度平板能精確地測定MIC，推算藥物的原始濃度，能更好地保證質(zhì)控試驗的可靠性。當(dāng)按照美國臨床實驗室標準委員會(C

3、linical LaboratoryStandards Institute，CLSI)或歐盟藥敏試驗委員會(European Committee onAntimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)的S(Susceptible)、I(Intermediate)、R(Resistant)范圍標準設(shè)置0-S、S-R、R-8R這樣三個線性梯度，首先可以判斷菌株敏感性范圍及細菌群落精確的MIC值，并能分離

4、出抗性菌株，預(yù)警該抗生素使用后可能出現(xiàn)的抗藥性，進而指導(dǎo)臨床藥物的選擇和應(yīng)用。如果自動化生產(chǎn)即用型梯度平板，將便利臨床藥敏試驗，改進抗藥性篩選技術(shù)。
　　以半固體雙層平板噬菌斑法針對上述流行性耐藥大腸桿菌共分離純化到大腸桿菌噬菌體143株。挑選主要ST型菌株ST155對應(yīng)的3株大腸桿菌噬菌體進行了測序和電鏡觀察，噬菌體均屬于有尾目、肌尾科T4噬菌體類型，由二十面體頭部與尾部組成，其中vB-EcolP-YSF1為新型噬菌體，與已測序

5、噬菌體只有11％的相似性。vB-EcolP-XT4、vB-EcolP-RZⅢ與vB-EcolP-YSF1生物學(xué)特性分析表明，噬菌體效價均可達到109 pfu/ml，且熱穩(wěn)定性較好，在60℃溫度下保溫1h后噬菌體效價仍可達到107 pfu/ml以上;最適生長溫度均在37℃左右;在pH值為4-10的區(qū)間內(nèi)能保持較好的裂解活性，最適pH偏中性;噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)一般在0.1-1之間，噬菌體在感染宿主菌后的潛伏期一般為20 min。
　

6、　通過大腸桿菌含有的毒力基因數(shù)目與其半數(shù)致死量確定攻毒菌株，以棋盤法試驗優(yōu)化最佳感染復(fù)數(shù)，確定大腸桿菌噬菌體vB-EcolP-YSF1與大腸桿菌E.YSF-1肝作用的最佳濃度比，噬菌體治療采用胸肌注射肉雞，表現(xiàn)出了較好的治療效果，并隨著噬菌體效價的提高，肉雞的死亡率降低;噬菌體口服治療SPF雞實驗采用同時口服噬菌體vB-EcolP-RZⅢ與高抗的致病性大腸桿菌，噬菌體治療組比只口服致病菌組糞樣中該高抗的致病性大腸桿菌降低了至少1個數(shù)量級