引入反向重復序列的腺病毒在肝癌介導選擇性表達和溶瘤.pdf

1、博士學位論文中文摘要摘要腺病毒載體目前廣泛應用于腫瘤基因治療的基礎研究和臨床試驗。近年來發(fā)展了一些新的載體構建策略使其效應獲得腫瘤選擇性，引入反向重復序列便是其中之一。El基因刪除的腺病毒載體能選擇性地在腫瘤細胞中復制病毒DNA，在其目的基因兩側插入反向重復序列，當病毒DNA在腫瘤細胞中復制時介導同源重組，激活目的基因，實現基因轉移的腫瘤選擇性。我們研究了根據這個策略構建的載體Ad.lRBG在原發(fā)性肝癌和結腸轉移性肝癌實驗性治療中的效果

2、。我們首先證實Ad.lRBG在體外能選擇性地在肝細胞癌(SMMC7721MHCC97)和結腸癌(LoVoHT29)細胞中表達報告基因(agal)，而在正常肝細胞(WB)中的表達水平極低。不含反向重復序列的腺病毒載體Ad.BG表達pgal沒有選擇性。通過尾靜脈注射，Ad.lRBG能選擇性地在SMMC7721和LoVo裸鼠肝臟移植瘤內表達卜gal，腫瘤和瘤周肝表達比顯著高于Ad.BG。使用DNA合成抑制劑羚基脈能抑制Ad.lRBG感染的腫瘤

3、細胞內病毒DNA的重組及卜gal的表達，而不影響Ad.BG的表達。這些結果說明Ad.lRBG表達目的基因依賴病毒DNA在腫瘤細胞內復制和重組，非腫瘤細胞被其感染后無此過程，目的基因因此不表達，是選擇性表達的機制。我們進一步發(fā)現，Ad.IRBG還能選擇性在腫瘤細胞中產生溶瘤效應(Oncolysis)aAd.lRBG感染的SMMC7721和LoVo細胞發(fā)生明顯的生長抑制和病理形態(tài)變化，利用“再感染”試驗和實時PCR，在其培養(yǎng)液中能檢測到具有

4、感染性的病毒顆粒且數量呈指數增長，提示是病毒大量復制引起溶瘤。Ad.lRBG局部注射能抑制SNMC7721和LoVo肝臟移植瘤的生長，顯示直接的腫瘤殺傷作用，而Ad.BG無此作用。盡管Ad.lRBG感染的WB細胞內也存在病毒DNA復制，卻檢測不到病毒顆粒，Western印跡在Ad.lRBG感染的SMMC7721和LoVo細胞中能檢測到病毒衣殼蛋白，WB細胞則無。說明腫瘤細胞和正常細胞對病毒衣殼蛋白合成的激活存在差別，可能是Ad.IRBG

5、在腫瘤細胞中選擇性地復制的原因之一。引入反向重復序列的腺病毒載體AdJRBG除選擇性地在肝癌中表達目的基因外，還能在腫瘤細胞內復制引起溶瘤效應而產生直接殺傷作用，這是本研究的新發(fā)現。這種聯(lián)合基因轉移和溶瘤效應并具有腫瘤選擇性的腺病毒載體可成為肝癌基因治療的新方向。關鍵詞:肝癌，基因治療，腺病毒載體，治療靶向性博士學位論文中文詳細摘要中文詳細摘要肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉移、復發(fā)等病理機制在分子和基因水平得到認識和闡明，使基因治療成為最具前景的治

6、療方式。各種不同策略的肝癌基因治療方案正在基礎研究和臨床試驗兩個層面展開，腺病毒載體由于其諸多優(yōu)點而成為肝癌基因治療最常用的載體。獲得腫瘤選擇性的治療效應是腫瘤治療的一個重要原則。腺病毒載體用于肝癌治療的腫瘤選擇性問題有其特殊性。腺病毒載體能高效率地感染肝臟內正常肝細胞，而肝癌細胞由于惡性表型丟失細胞表面CAR表達，攝取載體效率低。這使腺病毒載體難以在肝癌細胞中獲得高效率的治療效應。設計和使用具有腫瘤選擇性的腺病毒載體成為有效治療的關鍵

7、。目前使用腫瘤特異性的啟動子如AFP和CEA分別在原發(fā)性和結腸轉移性肝癌組織中獲得選擇性的表達或溶瘤，但表達效率，選擇性仍差。在腺病毒基因組中引入反向重復序列是獲得腺病毒載體腫瘤選擇性的新策略，被初步證明是有效的。本課題研究了引入反向重復序列的腺病毒載體在原發(fā)性和結腸轉移性肝癌中能否獲得腫瘤選擇性的治療效應，并探討相關機制。第一部分載體的設計思路，構建、擴增及鑒定引入反向重復序列使腺病毒載體產生腫瘤選擇性的基因表達，這個設計基于兩個發(fā)現

8、。一是EIA刪除的腺病毒載體(Ad.El一)能在腫瘤細胞中復制其DNA.二是在腺病毒基因組中加入反向重復序列，病毒DNA在被感染細胞中可發(fā)生同源重組，產生新的雙鏈DNA形式。美國華盛頓大學的一個研究小組利用這兩個發(fā)現設計了新載體。以Ad.E1載體作為基本骨架，將目的基因反向置于啟動子下游并在其兩側插入反向重復序列，當其在宿主細胞內復制DNA時發(fā)生重組，產生的新的病毒DNA形式中目的基因被恢復為與啟動子同向而被表達。Ad.E1載體能在腫瘤