9型腺相關病毒介導R65核酶基因轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞對NF-κB信號通路干預的研究.pdf

1、目的：以9型腺相關病毒（Recombinant Adeno-associated Virus Serotyoe9, rAAV9）為載體介導R65核酶基因重組成rAAV9-eGFP-R65轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs），觀察是否能抑制氧化型低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，ox-LDL）誘導的HUVECs細胞N

2、F-κB通路的激活，進而減輕細胞炎癥反應和細胞凋亡。
　　方法：傳代培養(yǎng)HUVECs，用rAAV9轉染HUVECs細胞，流式細胞儀測定細胞的轉染效率，選擇最佳轉染效率進行轉染，并檢測 rAAV9的HUVECs和人主動脈平滑肌細胞（Human Aortic Smooth Muscle Cells，HASMCs）的轉染效率區(qū)別。氧化型低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，ox-LDL）誘導HU

3、VECs細胞激活NF-κB通路，rAAV9-eGFP-R65轉染HUVECs抑制ox-LDL誘導的NF-κB激活，Western blot檢測各組細胞P65和P50蛋白的表達，免疫熒光定位檢測 NF-κB通路 P65和P50的轉位激活，ELISA檢測NF-κB通路下游相關蛋白表達。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　結果：（1）流式結果顯示當 MOI為1×107 v.g./cel1時rAAV9-eGFP-R65在HUVECs和HAS

4、MCs的轉染效率分別為(52.8±2.05)％和(52.40±3.21)％。倒置熒光顯微鏡及流式細胞儀結果均顯示rAAV9-eGFP-R65可高效穩(wěn)定轉染HUVECs和HASMCs，eGFP的表達高峰分別在第6天和第5天。（2）Western blot結果顯示：ox-LDL或高脂血清均可誘導HUVECs激活NF-κB信號通路，導致P65和P50核蛋白表達增高，并且ox-LDL誘導存在濃度和時間劑量關系。（3）Western blot結果

5、顯示 rAAV9-eGFP-R65轉染HUVECs可顯著抑制NF-κB通路P65和P50核蛋白表達。免疫熒光定位檢測發(fā)現(xiàn)，rAAV9-eGFP-R65轉染組可明顯減輕ox-LDL誘導的P65核轉位。（4）ELISA結果顯示，rAAV9-eGFP-R65轉導可有效減輕ox-LDL誘導的HUVECs細胞炎性損傷和細胞內(nèi)皮功能損傷。（5）流式細胞儀結果顯示，rAAV9-eGFP-R65轉導可有效減輕ox-LDL誘導的HUVECs細胞凋亡。