FILIP-1L蛋白抗體制備及其生物學功能檢測.pdf

1、背景:
　　 肝細胞癌是一種全球常見的高致死率肝臟病變，它也是我國主要高發(fā)和高致死性癌癥之一。臨床和實驗室研究結果表明，HBV，HCV感染誘導的慢性肝病和肝硬化，黃曲霉毒素和其它致癌化合物污染食品，基因突變等是誘發(fā)肝癌的主要病因。它們通過誘導激活多個肝細胞基因的異常表達而促使肝細胞癌變，如c-myc、pRB，p53和熱休克蛋白等。
　　 熱休克蛋白不僅能調(diào)節(jié)正常細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，而且還參與調(diào)控多種組織器官癌癥(包括肝細胞癌)的

2、發(fā)生、轉移和藥物耐受。Hsf1是調(diào)控熱休克蛋白表達的主要轉錄因子，它對一些特異組織的腫瘤發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。如Hsf1在肝癌病人組織中表達升高。敲除小鼠Hsf1能抑制DMBP，誘導的皮膚癌，突變P53誘發(fā)的淋巴癌和DEN誘導的肝癌。而Hsf1調(diào)控肝癌發(fā)生的分子機理還在研究中。近期報道Hsf1能與FILIP-1L(FilaminAinteractingprotein1-like，alsoknownasdown-regulatedino

3、variancancer1，Doc1)結合。FILIP-1L能抑制Hsf1蛋白表達和Hsf1介導的熱休克反應。目前對FILIP-1L基礎生物功能的研究還很局限。FILIP-1L主要表達在不同的上皮組織中。它在卵巢癌細胞系，卵巢癌上皮、HPV16E7永生化的前列腺上皮中表達量降低，參與抑制腫瘤細胞的轉移調(diào)控。因此，認為FILIP-1L具有抑癌基因的潛在功能，而這方面還需更多的研究資料支持。FILIP-1L在肝癌發(fā)生，發(fā)展中的作用還沒有研究

4、和報道，該課題將以肝癌細胞系和病人肝癌組織為材料，探討FILIP-1L在肝癌發(fā)生中的作用。
　　 目的:
　　 研究FILIP-1L在肝癌中的表達及生物學作用，探討FILIP-1L相互作用的蛋白及功能。
　　 方法:
　　 1，制備FILIP-1L抗體：將已構建好的質粒pGEX-4T3-FILIP-1L，轉化受體菌E.coliBL21，經(jīng)IPTG誘導表達GST-FILIP-1L(1-288)融合蛋白，采用

5、GST親和純化方法，純化GST-FILIP-1L(1-288)融合蛋白。將融合蛋白免疫動物，制備FILIP-1L多克隆抗體，然后利用硫酸銨沉淀法和親和層析技術純化抗體，鑒別抗體特異性；2，利用RT-PCR技術及免疫印跡技術檢測不同肝癌細胞系中FILIP-1L基因及蛋白的表達；3，利用脂質體轉染技術，建立過表達和沉默F(xiàn)ILIP-1L的肝癌細胞株，利用MTT法、細胞遷移實驗和軟瓊脂克隆實驗，檢測FILIP-1L對肝癌細胞系PLC/PRF/5

6、的生長、遷移和成瘤性的影響；4，利用免疫共沉淀技術，研究FILIP-1L和Rb之間的相互結合及對抑癌的作用機理。
　　 結果:
　　 利用受體菌E.coliBL21，成功誘導表達出GST-FILIP-1L(1-288)融合蛋白，免疫動物后獲得高效價多克隆抗體。RT-PCR及免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，不同肝癌細胞系均有FILIP-1L基因和蛋白的表達，且FILIP-1L蛋白在肝癌組織的表達量高于癌旁組織。成功建立過表達及沉默F(xiàn)IL

7、IP-1L的肝癌細胞PLC/PRF/5，經(jīng)MTT、細胞遷移實驗及軟瓊脂克隆實驗發(fā)現(xiàn)，與空載體對照肝癌細胞株PLC/PRF/5比較，過表達FILIP-1L的肝癌細胞株PLC/PRF/5的生長速度減慢、相對遷移距離變小、軟瓊脂克隆形成數(shù)減少；而沉默F(xiàn)ILIP-1L的肝癌細胞PLC/PRF/5生長速度增快、相對遷移距離增長、軟瓊脂克隆形成數(shù)增多。免疫印跡結果顯示，過表達FILIP-1L的肝癌細胞株PLC/PRF/5及人胚腎細胞株293T中Rb

8、蛋白的表達量減少，而沉默F(xiàn)ILIP-1L的肝癌細胞株Rb蛋白表達量增高。免疫共沉淀結果顯示，在肝癌細胞系PLC/PRF/5內(nèi)，Rb與FILIP-1L相互結合。
　　 結論:
　　 獲得了GST-FILIP-1L(1-288)融合蛋白，制備了FILIP-1L的多克隆抗體。不同的肝癌細胞系和肝癌組織中均有FILIP-1L表達。FILIP-1L能抑制肝癌細胞系PLC/PRF/5的生長、遷移和成瘤性。在肝癌細胞系PLC/PRF/