血管靶向性載VEGF165基因納米粒子在治療肢體缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的: 近年來(lái)，外周動(dòng)脈疾病的發(fā)病率逐年升高，尤其是下肢缺血性疾病已經(jīng)成為危害人類(lèi)健康的嚴(yán)重疾病。目前針對(duì)下肢缺血性疾病主要手段是藥物、外科手術(shù)、腔內(nèi)治療等。但是對(duì)于遠(yuǎn)端流出道嚴(yán)重狹窄尤其是合并糖尿病的患者往往沒(méi)有手術(shù)機(jī)會(huì)，目前還缺乏令人滿(mǎn)意的治療方法。應(yīng)用各種方法和手段促進(jìn)新生血管生成，促進(jìn)缺血肢體側(cè)枝循環(huán)的建立，是有效可行的研究方向之一。 基因治療是目前研究較多的治療缺血性疾病的一項(xiàng)新技術(shù)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(V

2、EGF)在治療缺血性疾病中的作用已經(jīng)得到肯定，它能增加小血管的通透性、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并能刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物，從而有力地促進(jìn)血管新生。但是，目前對(duì)于VEGF基因治療仍存在著許多局限性：(1)外源性VEGF雖能促進(jìn)血管生成，但其靶向治療能力差，因此要達(dá)到治療下肢缺血目的所需的劑量較大，而增大劑量勢(shì)必增加其副作用，甚至還有增加促腫瘤生成和加重糖尿病性視網(wǎng)膜病變的潛在風(fēng)險(xiǎn)。(2)病毒性基因載體轉(zhuǎn)染效率高，

3、但其促腫瘤生成、細(xì)胞毒性和免疫原性等安全性問(wèn)題需要重視。后來(lái)發(fā)展的非病毒性載體，如陽(yáng)離子聚合物，毒性小，安全性較高。其中殼聚糖作為一種天然陽(yáng)離子聚合物的非病毒基因載體，顯示了較好的前景。它具有細(xì)胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低等優(yōu)點(diǎn)。其納米粒子形式包載DNA，載藥量較大，可以保護(hù)DNA在體內(nèi)不被酶降解，還能起到緩慢釋放DNA的效果。但其細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，生物靶向性較差，因而也限制了它在基因治療方向的應(yīng)用。 因此，如何優(yōu)化基因

4、載體和增強(qiáng)局部治療的靶向性是目前基因治療需要解決的主要問(wèn)題。 RGD肽是一類(lèi)含有精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg—Gly—Asp)的短肽，其作用是通過(guò)和整合素的特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。整合素αvβ3是含有數(shù)個(gè)RGD位點(diǎn)的細(xì)胞受體，在血管生成過(guò)程中起到重要的作用。在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表面αvβ3整合素呈低水平表達(dá)，但在缺血狀態(tài)下的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中αvβ3的表達(dá)顯著上升。利用外源性RGD對(duì)整合素αvβ3的靶向結(jié)合特性，可以攜帶促進(jìn)新生血

5、管生成的藥物或基因進(jìn)入體內(nèi)缺血局部起治療作用，從而治療肢體缺血等疾病。 為提高殼聚糖納米粒子非病毒基因載體的轉(zhuǎn)染效率和生物靶向性，并將其應(yīng)用于治療缺血性疾病，本研究通過(guò)以共價(jià)鍵將RGD多肽結(jié)合在殼聚糖上，制備成納米粒子基因載體，并包載VEGF165質(zhì)粒，分別通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察其靶向特異性和生物學(xué)效應(yīng)，從而為基因靶向治療缺血性疾病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 內(nèi)容和方法: 1.RGD肽表面修飾殼聚糖載基因納

6、米粒子(CH—RGD)及FITC標(biāo)記納米粒子(FITC—CH—RGD)的制備，X射線(xiàn)光電子譜(XPS)進(jìn)行材料定性，透射電鏡測(cè)量納米粒子的粒徑，凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)確定最大質(zhì)粒包封率的N/P值。 2.體外Hy926內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)： (1)利用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)觀察內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)FITC—CH—RGD和FITC—CH納米粒子的結(jié)合和吞噬情況比較； (2)包載pEGFP—C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hy926細(xì)胞，分為3組：CH—

7、RGD-PEGFP組、CH-PEGFP組和Lipofetamine2000-pEGFP組，轉(zhuǎn)染后48h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率； (3)包載pIRES2—VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hy926細(xì)胞，分為3組：CH—RGD-PVEGF165組、CH-PVEGF165組和Lipofetamine2000-pVEGF165組，分別于轉(zhuǎn)染后第1，3，7，14天取上清用ELISA法測(cè)定VEGF蛋白表達(dá)； (4)倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)

8、胞檢測(cè)日期的形態(tài)及存活情況。 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)： (1)建立小鼠股動(dòng)脈結(jié)扎切斷后肢缺血模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求分為CH—RGD-PVEGF165治療組、CH-PVEGF165治療組、pVEGF質(zhì)粒治療組和空白對(duì)照組。給藥方式為患肢肌肉注射，于結(jié)扎股動(dòng)脈后7天后給藥。 (2)分別于給藥后3天、7天、14天取材缺血側(cè)腓腸肌組織和對(duì)側(cè)腓腸肌組織；行HE染色、免疫組化染色(PCNA、VEGF)評(píng)價(jià)肌肉組織間的新生毛細(xì)血管生成、VE

9、GF表達(dá)情況；Real Time-PCR檢測(cè)VEGF mRNA含量及Western Blot檢測(cè)VEGF表達(dá)含量。 結(jié)果: 1.以共價(jià)鍵將RGD多肽結(jié)合在殼聚糖上，制成納米粒子形式，X射線(xiàn)光電子譜證實(shí)產(chǎn)物為CH—RGD；透射電鏡測(cè)得粒徑范圍為30～50nm；包載質(zhì)粒DNA后，凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)顯示最大質(zhì)粒包封率時(shí)N/P值為2：1。 2.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)： 將制得的FITC熒光標(biāo)記RGD肽表面修飾的殼聚糖納米粒子

10、加入體外培養(yǎng)的Hy929細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)其在體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有很強(qiáng)的靶向結(jié)合特性，而且能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞作用。 包載EGFP質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染Hy926細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，CH—RGD-PEGFP組較CH-PVEGF165組轉(zhuǎn)染效率明顯提高(35.7％vs14.3％，p<0.001)，較Lipofetamine2000-pEGFP組稍增高(35.7％vs31.3％，p>0.05)； 包載VEGF165

11、質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染Hy926細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，CH—RGD—VEGF165轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中VEGF濃度在轉(zhuǎn)染后1、3、7、14天均較其他兩組明顯增高。(除第1天CH—RGD—VEGF165轉(zhuǎn)染組與Lipo-PVEGF165組比較p>0.05外，其余p值均<0.01。) CH—RGD-PVEGF165組及CH-PVEGF165組于轉(zhuǎn)染后1、3、7、14天存活細(xì)胞總數(shù)均較Lipo-PVEGF165組有顯著性差異(p值均<0.01)，而CH—R

12、GD-PVEGF165組和CH-PVEGF165組之間無(wú)明顯差異。表明CH—RGD在體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性。 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)： 在后肢缺血模型小鼠中，HE染色和PCNA免疫組化染色顯示CH—RGD-PVEGF165治療組較其余各組缺血肢體中新生毛細(xì)血管生成明顯增多，而組織缺血表現(xiàn)較輕；每張HE染色切片在×100倍隨機(jī)5個(gè)視野計(jì)數(shù)毛細(xì)血管的數(shù)目也明顯增多(p值均<0.01)；VEGF免疫組化顯示毛細(xì)血管內(nèi)皮和周?chē)M織中

13、VEGF表達(dá)顯著增高； Real-Time結(jié)果顯示，CH—RGD-PVEGF165治療組較其余各組和健側(cè)肌肉中VEGFmRNA的表達(dá)量明顯增高。(p值均<0.01) Western Blot結(jié)果顯示：CH—RGD-PVEGF165治療組較其余各組和健側(cè)肌肉中VEGF的表達(dá)顯著增高。(p值均<0.01) 治療后到14天觀察，CH—RGD-PVEGF165治療組和CH-PVEGF165治療組未見(jiàn)患肢壞死、感染，組織水

14、腫不明顯。而pVEGF165治療組及空白對(duì)照組見(jiàn)足趾局灶性壞死，其中C組2只，占總數(shù)的33％；D組3只，占D組總數(shù)的50％。 結(jié)論: 1.RGD肽表面修飾的CH納米粒子在體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有很強(qiáng)的靶向結(jié)合特性，而且能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞作用。 2.RGD肽表面修飾的CH納米粒子作為基因載體，其體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比殼聚糖納米粒子明顯提高，較Lipofetamine2000稍增高；包載VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞