ADAM33表達(dá)量與氣道平滑肌細(xì)胞生物力學(xué)屬性的關(guān)系研究.pdf

1、哮喘(Asthma)是一種常見的慢性呼吸道系統(tǒng)疾病，涉及環(huán)境因素與遺傳因素之間的復(fù)雜相互作用，是公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。然而其生理病理機(jī)制至今還沒有得到完全地解釋。有研究表明，哮喘的病理機(jī)制中包括氣道重塑(airway remodeling)，氣道炎癥(Airway inflammation)以及氣道高反應(yīng)性(Airway hyperresponsiveness，AHR)等。目前國際上公認(rèn)的哮喘可能的發(fā)病機(jī)制是，氣道平

2、滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cell,ASMC)自身生物力學(xué)屬性發(fā)生改變，當(dāng)受到外界理化因素刺激時(shí)，其反應(yīng)性增強(qiáng)導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性與氣道狹窄以及隨之而來的呼吸功能障礙。因此氣道平滑肌生物力學(xué)屬性變異作為此途徑的終極因素成為研究哮喘生理病理機(jī)制的重點(diǎn)。
　　近年來，通過定位克隆和全基因組篩查技術(shù)確定了去整合素堿金屬蛋白酶33(A disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM

3、33)是一種哮喘易感基因，且發(fā)現(xiàn)ADAM33基因與哮喘疾病特征的氣道炎癥和組織重構(gòu)具有一定聯(lián)系。然而與氣道炎癥同等重要的哮喘氣道病理變化是源于ASMC生物力學(xué)屬性改變所導(dǎo)致的AHR，且已有研究表明ADAM33在哮喘患者氣道組織的間充質(zhì)層包括成纖維層、基底膜和平滑肌層上的表達(dá)水平比正常人高。由此認(rèn)為在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中ASMC的ADAM33蛋白表達(dá)與ASMC生物力學(xué)屬性是否具有一定的相關(guān)性、以及ADAM33蛋白的表達(dá)是否參與調(diào)控ASMC力

4、學(xué)特性。為了解決這個(gè)問題，本課題采用卵清蛋白(OVA)致敏新生雄性SD大鼠構(gòu)建哮喘動(dòng)物模型，在此基礎(chǔ)上分離純化ASMC在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)，研究哮喘病理氣道中ASMC的ADAM33蛋白表達(dá)水平，及其與ASMC生物力學(xué)行為之間的相關(guān)性，同時(shí)檢測在體外調(diào)控ADAM33蛋白表達(dá)后ASMC細(xì)胞生物力學(xué)行為的響應(yīng)，研究兩者之間的關(guān)系。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　?、傺芯苛瞬煌潭萇VA致敏雄性SD大鼠哮喘模型ASMC的ADAM33蛋白表達(dá)水平

5、。首先將新生雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，哮喘組在第1和第7天時(shí)注射含1％OVA和10%Al(OH)3的混合鹽溶液，第15天起用1%OVA每周霧化3次，分別持續(xù)4、6和12周以建立不同程度慢性O(shè)VA致敏動(dòng)物，正常對照組動(dòng)物用相同的實(shí)驗(yàn)方案采取同等劑量的生理鹽水處理。從動(dòng)物模型中分離、獲取ASMC并在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代至2-5代用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞長至90%融合時(shí)，提取總蛋白，將等體積的蛋白溶液加入到10%SDS-PAGE膠中，隨后用

6、免疫印記方法(western blot)檢測細(xì)胞中ADAM33蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OVA致敏組ASMC中ADAM33蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(p<0.001)，增加水平在OVA致敏4周時(shí)達(dá)到最大，致敏6和12周表達(dá)水平漸次。
　　②研究了正常與OVA致敏來源的ASMC生物力學(xué)屬性。從氣道的功能來看，ASMC的力學(xué)屬性被認(rèn)為是決定哮喘病癥之一氣道高反應(yīng)的最終途徑。因此本研究綜合采取光學(xué)磁粒扭轉(zhuǎn)細(xì)胞測量儀(Optical Ma

7、gnetic Twisting Cytometry,OMTC)、傅立葉變換牽引力顯微術(shù)(Fourier Transform Traction Microscopy,FTTM)、Transwell小室法以及免疫熒光染色技術(shù)檢測包括細(xì)胞剛度和收縮性、細(xì)胞牽引力、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)在內(nèi)的細(xì)胞力學(xué)屬性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比OVA致敏組ASMC細(xì)胞剛度增加，致敏4周時(shí)具有顯著性差異(p<0.05)，隨后漸次，然而各組細(xì)胞對KC

8、l激動(dòng)劑的響應(yīng)沒有顯著性差異。同樣，OVA致敏組中ASMC牽引力提高，尤其在OVA致敏4周時(shí)具有顯著性差異(p<0.05)，隨后隨著致敏時(shí)間的增加有所降低。OVA致敏組ASMC的遷移能力增加，同樣的致敏4周時(shí)達(dá)到最大具有顯著性差異(p<0.001)。致敏組ASMC中包括F-actin和Vinculin的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)較對照組有所提高，特別是致敏4周時(shí)，Vinculin的表達(dá)具有顯著性差異（p<0.001）。
　　③分析了A

9、DAM33蛋白表達(dá)水平與ASMC力學(xué)屬性之間的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ASMC的ADAM33蛋白表達(dá)的變化和ASMC力學(xué)屬性的改變對OVA致敏具有相同的響應(yīng)趨勢，暗示兩者之間似乎具有一定的相關(guān)性。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ASMC中ADAM33蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞剛度、細(xì)胞牽引力、細(xì)胞遷移以及包括F-actin和Vinculin的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)在內(nèi)的細(xì)胞力學(xué)屬性具有很強(qiáng)的正相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)Cp：分別是0.864，0.716，0

10、.67，0.662，0.774，如表3.1所示)。
　　④研究了調(diào)控ADAM33蛋白表達(dá)后ASMC細(xì)胞力學(xué)屬性的響應(yīng)。用上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的蛋白表達(dá)與力學(xué)屬性改變最大的OVA致敏4周的ASMC，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的辦法構(gòu)建沉默ADAM33蛋白表達(dá)的ASMC組，然后檢測細(xì)胞的力學(xué)屬性響應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與無處理對照組(4weeks)以及慢病毒轉(zhuǎn)染對照組(GFP)相比，沉默組(pLVT453)細(xì)胞的剛度與細(xì)胞牽引力都顯著下降(p<0.05