大鼠尾椎間盤(pán)退變過(guò)程中COMP、ADAMTS-7、ADAMTS-12的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化研究.pdf

1、COMP(Cartilage oligomeric matrix protein)是軟骨組織內(nèi)一種非膠原蛋白成分。除軟骨外,該蛋白同樣也存在于肌腱、骨和滑膜中。COMP分子是由5個(gè)分子量110kD單體聚合而成的五聚體。在以往的研究中,COMP已被證明具備催化膠原纖維形成的能力,并可與膠原和軟骨聚集蛋白聚糖(aggrecan)等相結(jié)合。COMP與膠原及軟骨聚集蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)主要成分可以相互結(jié)合預(yù)示著COMP在基質(zhì)中可能起到舉足輕重的

2、作用。近來(lái),人們發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶家族——ADAMTS(a disilategrin and metalloproteinase with thrombospondinmotifs)可以分解細(xì)胞外基質(zhì)成分。ADAMTS家族于1997年被發(fā)現(xiàn),并被證實(shí)有重要的生物學(xué)作用。在ADAMTS家族成員中,ADAMTS-7和ADAMTS-12具有金屬蛋白酶特性,可以直接結(jié)合并分解COMP。ADAMTS-7在骨、軟骨、滑膜、肌腱和韌帶中均有表達(dá),ADAM

3、TS-12在軟骨、滑膜和肌腱中有表達(dá)。COMP也在以上提及的各個(gè)組織中有表達(dá)。曾有學(xué)者報(bào)道在正常椎間盤(pán)中亦發(fā)現(xiàn)COMP的存在,但正常椎間盤(pán)中是否有ADAMTS-7以及ADAMTS-12表達(dá),并且在間盤(pán)退變過(guò)程中ADAMTS-7、ADAMTS-12以及COMP是否會(huì)有相關(guān)的變化都未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 目的：
　　 眾所周知,在椎間盤(pán)退變過(guò)程中諸如髓核纖維化等組織形態(tài)上的變化是由于細(xì)胞丟失和細(xì)胞外基質(zhì)降解所導(dǎo)致。椎間盤(pán)

4、細(xì)胞外基質(zhì)降解包括間盤(pán)中蛋白多糖、水和Ⅱ型膠原的丟失。在這個(gè)降解過(guò)程中,椎間盤(pán)活性細(xì)胞是不斷減少的。在本實(shí)驗(yàn)中,我們建立了符合上述特點(diǎn)的間盤(pán)退變模型,并在此基礎(chǔ)上觀察了間盤(pán)退變過(guò)程中COMP,ADAMTS-7及ADAMTS-12的動(dòng)態(tài)改變。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道了髓核中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)情況以及在間盤(pán)退變過(guò)程中ADAMTS-7、ADAMTS-12和COMP的表達(dá)改變情況。
　　 材料與方法
　　 動(dòng)物分組

5、:本研究采用平均體重為350-400g的SD大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組中的大鼠分為6組每組8只,每只大鼠于第4和第5尾椎之間的尾椎間盤(pán)施加恒定的1.3MPa靜壓力,加壓時(shí)間點(diǎn)為6小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、1天、4天及7天,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)以過(guò)量氯胺酮處死一組大鼠并取材。對(duì)照組大鼠的尾椎間盤(pán)不施加任何靜壓力,其分組和取材與實(shí)驗(yàn)組一樣。
　　 間盤(pán)退變模型的建立:通過(guò)對(duì)尾椎間盤(pán)施加靜壓力建立退變模型的方法國(guó)外曾有報(bào)道[1

6、8]。大鼠以氯胺酮麻醉后,通過(guò)觸診辨別出第4,5尾椎問(wèn)盤(pán),以小型電鉆將直徑為0.4毫米的不銹鋼針經(jīng)皮鉆入鄰近間盤(pán)的椎體,在每個(gè)椎體中垂直鉆入兩個(gè)鋼針,相鄰兩椎體鋼針保持平行。用帶有刻度的彈力皮套套入相鄰兩椎體的平行鋼針末端,從而對(duì)椎間盤(pán)施加1.3MPa的靜力壓。將塑料圓筒套至受壓椎體及椎間盤(pán)的表面以防大鼠啃咬。尾椎間盤(pán)施壓期間大鼠允許自由活動(dòng)。在加壓不同時(shí)間點(diǎn)(6小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、1天、4天及7天),以過(guò)量氯胺酮處死相應(yīng)的大鼠。

7、取出間盤(pán)中的髓核作進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。
　　 細(xì)胞凋亡:取材后制成組織切片,切片中的凋亡細(xì)胞用以Tunel法測(cè)定。Tunel試驗(yàn)步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(Roche)。切片中染成棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。以PCI軟件行顯微鏡下圖像捕捉及凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　 RNA提取:第4,5尾椎間盤(pán)的髓核在取材后以顯微器械仔細(xì)分離出來(lái)后用于RNA提取,總RNA以RNAisoTM Plus(Takara)提取,提取步驟依照說(shuō)明書(shū)

8、操作。總RNA量以微量測(cè)樣器(Implen)測(cè)量。
　　 RT-PCR:應(yīng)用。TAKARA RNA PCR Kit(AMV)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。首先反轉(zhuǎn)錄50ng的總RNA成為CDNA。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制50μl的PCR體系。引物序列參看表1。PCR.反應(yīng)采取35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)的具體條件為:(1)變性:95℃1分鐘;(2)退火:時(shí)問(wèn)為1分鐘,各目的基因的退火溫度各不相同,ADAMTS-7,ADAMTS-12及COMP退火

9、溫度為60℃,collagenⅡ退火溫度為56℃,aggrecan退火溫度為61℃,GAPDH退火溫度為58℃;(3)延伸:72℃1分鐘。擴(kuò)增之后進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增之后的PCR產(chǎn)物。目的條帶以GeneFinder染色并以熒光顯像儀成像。
　　 蛋白提取及Western Blot:取材后以顯微器械仔細(xì)分離髓核,以含有蛋白酶抑制劑PMSF的蛋白裂解液將髓核裂解60分鐘。以BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)進(jìn)行蛋白定量,具體

10、步驟依據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)。等量的組織蛋白(50gg)在100V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE電泳3小時(shí)后,將凝膠上的條帶在70V電壓下轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜以COMP一抗(Abcam)孵育后,TBS液漂洗,0.5％BSA進(jìn)行封閉,而后用二抗孵育(北京中杉),TBS漂洗,最后進(jìn)行ECL發(fā)光。
　　 結(jié)果
　　 Tunel法細(xì)胞凋亡
　　 在實(shí)驗(yàn)組中,施加靜力壓1天后髓核開(kāi)始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。靜力壓持續(xù)施加7天時(shí),可觀察到

11、髓核中大量出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。而未施加靜力壓的對(duì)照組大鼠尾椎間盤(pán)中未觀察到凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞(圖1.11.21.3)
　　 細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的表達(dá)
　　 RT-PCR結(jié)果表明大鼠尾椎間盤(pán)靜力加壓時(shí)間少于18小時(shí)H型膠原的表達(dá)無(wú)明顯變化,18小時(shí)后其表達(dá)呈降低趨勢(shì),加壓至1天后Ⅱ型膠原表達(dá)開(kāi)始顯著降低。Aggrecan的表達(dá)變化趨勢(shì)與Ⅱ型膠原相似。
　　 大鼠尾椎髓核中的COMP基因表達(dá)是隨著靜力加壓時(shí)間的變化而變化的。靜

12、力加壓至18小時(shí),COMP表達(dá)呈明顯上升趨勢(shì),加壓18小時(shí)后COMP表達(dá)呈下降趨勢(shì)。在靜力加壓18小時(shí)時(shí)間點(diǎn)COMP表達(dá)呈顯著升高。當(dāng)靜力加壓持續(xù)至4天以后,COMP表達(dá)出現(xiàn)顯著減少。COMP的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與其RT-PCR表達(dá)趨勢(shì)一致。在COMP的Westernblot實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到大小約65kD的COMP片斷,該片斷的表達(dá)在間盤(pán)加壓1天后顯著增加。
　　 細(xì)胞外基質(zhì)中ADAMTS-7,ADAMTS-12在間盤(pán)退變過(guò)程中的表達(dá)變化

13、
　　 在正常的SD大鼠尾椎間盤(pán)中有ADAMTS-7及ADAMTS-12的表達(dá)。在間盤(pán)退變過(guò)程中,其表達(dá)總體呈增加趨勢(shì),與間盤(pán)基質(zhì)主要成分表達(dá)趨勢(shì)相反。ADAMTS-7及ADAMTS-12的表達(dá)自間盤(pán)靜力加壓1天起出現(xiàn)顯著升高。在間盤(pán)靜力加壓7天時(shí)間點(diǎn)觀察到ADAMTS-12的表達(dá)仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著升高,但在此時(shí)間點(diǎn)ADAMTS-7的表達(dá)則回落至正常水平,未見(jiàn)明顯升高。
　　 結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADAM