低能量激光對骨髓來源干細胞成骨分化過程基因表達的影響.pdf

1、目的:
　　 近些年，低能量激光照射(lowlevellaserirradiation，LLLR)陸續(xù)被報道具有良好的生物學作用，包括光生物學促進作用、光生物學調(diào)節(jié)功能等。通過文獻回顧可知，LLLR不僅能夠促進細胞生長，增強細胞代謝和細胞增殖，而且可以調(diào)節(jié)新生血管的生成、改善炎癥狀態(tài)。另外，實驗室研究結(jié)果顯示，通過照射LLLR成骨細胞的增殖以及成骨分化增加;動物實驗證實，照射低能量激光可以提高牙齒移動速度，促進骨折區(qū)新生骨生成，

2、加速骨愈合，另外可以降低疼痛。低能量激光所指指的可見紅光和紅外光，穿透能力較強，產(chǎn)熱較少，照射過程中熱損傷效應比較低。低能量激光廣泛的生物學作用以及創(chuàng)傷、疼痛等副作用少，可以對治療某些疾病產(chǎn)生優(yōu)越的作用。但是不同的文獻對于低能量激光對成骨過程的具體影響闡述并不完全一致，甚至呈現(xiàn)相反的效應模式;對于成骨分化過程中的人骨髓來源間充質(zhì)干細胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hBMSCs)受到LLLR照射

3、后其具體的生物學效用如何，LLLR通過何種生物學機制發(fā)揮作用，國內(nèi)外文獻報道不一?；谇捌诘膶嶒瀳蟮阑仡櫼约昂侠淼膶嶒炓蛩乜刂?，設計了本實驗。本研究通過分離人骨髓來源間充質(zhì)干細胞，探究分離以及培養(yǎng)該細胞的正確方法，摸索科學的實驗模式，建立hBMSCs細胞系，為將來與hBMSC相關的實驗項目做好細胞儲備。
　　 利用635nm可見紅光(visiblered，VR)和808nm紅外光(invisiblered,IR)兩種不同波長的低

4、能量激光，利用而激光管將低能量激光作為實驗因素導入，通過改變光照時間調(diào)節(jié)光照計量，探究人骨髓來源的干細胞在不同劑量不同波長的低能量激光照射下的反應，使用基因芯片技術(Microarray)篩選LLLR可以調(diào)節(jié)的成骨相關基因以及細胞信號通路，之后運用RT-PCR技術、western技術等在RNA水平、蛋白水平分析驗證成骨性基因的表達與激光照射之間是否存在如Microarray所示的關系，探究LLLR調(diào)節(jié)hBMSC成骨分化過程中基因表達的具

5、體機制，為解釋LLLR可以促進正畸治療過程中的牙齒移動以及成骨愈合提供新的證據(jù)和更好的解釋。
　　 方法:
　　 1、利用密度梯度離心法分離人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（新鮮人長骨骨髓購買于生物公司），并進行常規(guī)貼壁培養(yǎng)，P3～P5細胞用于實驗中。部分早期細胞(Pl～P3)進行低溫冷凍儲存于液氮罐中以備后期實驗使用。
　　 2、第二實驗階段，復蘇凍存BMSCs細胞，待細胞貼壁后將培養(yǎng)細胞所使用的常規(guī)培養(yǎng)液更換為成骨誘

6、導液連續(xù)培養(yǎng)2week，每隔1至2天換液一次。初次換液后即刻對細胞進行LLLR照射處理。低能量激光波長分別為635nm，808nm，照射劑量分別為0.5J/cm2，1.0J/cm2，1.5J/cm2，2.0J/cm2，計8個實驗組;另外BMSCs無光照處理組為對照組，共9組。加入誘導液2周后，收集被誘導分化的成骨細胞，應用基因芯片技術（Microarray技術）檢測外顯子水平上不同條件下各種基因的表達差異，篩選受LLLR影響其表達與對照

7、相比呈現(xiàn)統(tǒng)計性差異的基因，探究骨相關基因在激光照射下的表達差異。
　　 3、基于Microarray的實驗結(jié)果，簡化實驗條件，采用808nm激光以及0，0.5J/cm2，2.0J/cm2三種激光劑量，利用RT-PCR和western技術驗證其成骨過程相關基因表達和蛋白合成的差異，以驗證低能量激光對干細胞成骨基因分化表達的影響作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、從新鮮長骨骨髓中成功分離出人骨髓間充質(zhì)干細胞并子啊實驗室建

8、立該細胞系，部分早期hBMSCs細胞凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2、通過收集9種條件下各個實驗組以及對照組的全細胞RNA，利用基因芯片技術分析外顯子水平的基因表達情況。可知，不同波長、不同照射計量的激光對骨髓來源間充質(zhì)干細胞成骨分化過程的基因表達影響不同，隨著改變激光照射條件，基因表達呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，其中RANKL、IL-6、OPG、CTSK等基因的差異最為明顯，且在紅外波段表現(xiàn)出線性特點。同時，由基因芯片專業(yè)軟件繪制信號通路圖譜分析

9、，不論635nm波段還是808nm波段的激光處理，均可以對不同的信號通路產(chǎn)生生物學效應，有的呈現(xiàn)因激光照射表達增加的上調(diào)效應，有的則呈現(xiàn)下調(diào)效應表達相應的減少;尤其以紅外波段808nm激光照射條件下，TGF-β1信號通路的上調(diào)效應最為顯著，
　　 3、基于基因芯片的實驗結(jié)果，紅外波段激光照射生物學效應較可見光波段更為明顯。在實驗設計范圍內(nèi)，LLLR對不同基因的表達調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)線性調(diào)節(jié)作用，故而選用0.5J/cm2，2.0J/cm

10、2兩個實驗劑量以及0J/cm2作為空白對照設計實驗，處理成骨誘導過程中的hBMSCs，RT-PCR實驗結(jié)果顯示，對于不同的激光照射劑量，除了OCN、RANKL兩種基因的表達在實驗組內(nèi)部不存在統(tǒng)計性差異以外，Runx2、ALP、OCN以及RANKL的表達任兩組間相比較即存在統(tǒng)計學差異，照射時間增加激光的正向調(diào)節(jié)更為明顯。蛋白水平上，Western實驗進一步驗證808nm的低能量激光對骨相關基因具有明顯的上調(diào)作用，與RT-PCR的驗證結(jié)果相

11、一致，共同驗證了808nm特定波長的激光能夠促進成骨相關基因表達。
　　 結(jié)論:
　　 1、特定波長特定能量的低能量激光照射，都可以激發(fā)一系列不同的基因差異性表達。在眾多的基因中，部分基因可以對各種不同條件激光的照射均產(chǎn)生生物學效應;部分則只能對某種特定激光照射條件有反應。類似的是，另有部分基因在不同激光劑量的條件下，也存在互相重疊的現(xiàn)象。
　　 2、808nm的紅外波長條件下，在一定的激光劑量內(nèi)，組織再生相關基

12、因呈現(xiàn)出照射劑量依賴性特征，而這一特點在具有反向調(diào)節(jié)作用的基因表達上特征不明顯。Ingenuity軟件分析，基因之間相互調(diào)節(jié)各種作用互相交叉，激光照射可以起到各個通路的調(diào)控作用，包括上調(diào)和下調(diào)。
　　 3、808nm紅外光譜照射后，BMSCs細胞誘導成骨過程中，其成骨相關基因以及破骨相關基因表達都有增加，進一步證明激光對于成骨、破骨過程的生物學調(diào)控作用。但是鑒于實驗的設計以及時間的限制，尚且無法得出確定性結(jié)論激光如何準確的調(diào)控成