CXCR4基因在腎癌細胞核中核定位序列的研究.pdf

1、[目的]
　　 研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4核轉移與腎癌轉移相關，本實驗旨在探索在SDF-1刺激下引導CXCR4轉移至細胞核的關鍵核定位序列，為尋找抑制腎癌轉移的物質奠定理論基礎，進一步補充SDF-1/CXCR4生物軸的信號通路機制內容。
　　 [方法]
　　 利用核定位序列預測軟件PSORTⅡPrediction(http：//psort.ims.u-tokyo.acjp)進行CXCR4核定位序列在線分析，推測CXCR

2、4的可能核定位序列。以EGFP-CXCR4全長序列為模板，應用over-lapping PCR、酶切等方法獲得CXCR4核定位序列缺失的目的片段。將目的片段連接至pGEM-Teasy載體，酶切鑒定正確后與EGFP-N1分別進行酶切，將酶切產(chǎn)物連接，得到核定位序列缺失的EGFP-CXCR4突變體。將構建成功的突變體以及作為對照組的EGFP-CXCR4全長序列質粒和EGFP-N1空載體質粒分別轉染人腎胚293細胞，分別加入SDF-1刺激24

3、小時，同時設立不加SDF-1刺激組。光譜激光掃描共聚焦顯微鏡觀察不同質粒在人腎胚293細胞內的定位情況，從而判斷軟件預測的核定位序列的準確性。
　　 [結果]
　　 1.核定位序列軟件預測結果顯示：CXCR4的核定位序列位于氨基酸序列的第146位開始的RPRK，即cDNA序列：AGGCCAAGGAAG；
　　 2.構建的EGFP-CXCR4突變體經(jīng)酶切及測序鑒定，無堿基突變和讀碼框偏移，質粒構建成功；
　　

4、 3.光譜激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結果顯示：轉染人腎胚293細胞并加入SDF-1刺激24小時后EGFP-CXCR4全長質粒轉移至細胞核內，而EGFP-CXCR4核定位序列缺失的突變體未轉移至細胞核內。
　　 [結論]
　　 1.CXCR4的核定位序列位于氨基酸序列的第146位開始的RPRK，與核定位序列預測軟件分析結果相符合；
　　 2.阻斷CXCR4的核定位序列可能有助于抑制腎癌細胞的轉移；
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