缺氧誘導因子-1a基因轉染人間充質干細胞的體內促血管生成作用研究.pdf

1、目的:研究缺氧誘導因子-1α(hypoxia-induciblefactor1α，HIF-1α)基因轉染人間充質干細胞(humanmesenchymalstemcells，hMSCs)的體內促血管生成作用，為促進組織工程骨血管化提供新的方法和策略。 方法:1.HIF-1α基因轉染人間充質干細胞：將構建的pIRES3/HIF-1α逆轉錄病毒載體轉染PT67包裝細胞，制備含目的基因的重組逆轉錄病毒液，感染hMSCs，獲得穩(wěn)定高表達H

2、IF-1α的hMSCs。用RT-PCR法檢測轉基因hMSCs表達HIF-1α的水平，用免疫組化法檢測轉基因hMSCs在缺氧和常氧條件下HIF-1α蛋白的存在情況。 2.轉基因hMSCs體內促血管生成的研究：將轉基因hMSCs和未轉基因的hMSCs分別接種到13d的雞胚絨毛尿囊膜(chickenchorioallantoicmembrane，CAM)，3d后在解剖顯微鏡下原位觀察并拍攝血管，然后將CAM用Bouin's液固定，制片

3、，在顯微鏡下觀察并攝像。用Image-ProPlus4.5測量并分析血管面積。 結果:1.感染后的hMSCs經G418篩選后逐漸形成克隆，克隆中的hMSCs均表達EGFP，在倒置熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光。 2.缺氧條件下，轉基因hMSCs中HIF-1αmRNA表達較未轉基因的hMSCs明顯增高。 3.免疫組化法檢測HIF-1α蛋白結果顯示：缺氧組轉基因hMSCs細胞核內呈棕黃色，染色結果為陽性；常氧組轉基因

4、hMSCs細胞核未著色，染色結果為陰性。 4.CAM原位觀察：對照組CAM細胞團周圍血管走行稍曲折，血管生成不明顯；實驗組CAM細胞團周圍出現大量新生血管，以細胞團為中心呈放射狀排列。 5.CAM標本顯微鏡下觀察：實驗組CAM可見大量新生血管以細胞團為中心呈放射狀排列形成輻條輪狀。此外，細胞團內部可見密集的新生血管網。對照組細胞團周圍無明顯血管生成。試驗組CAM血管密度較對照組明顯增高。 6.圖像分析結果顯示實驗

5、組CAM較對照組CAM血管面積明顯增多，有顯著的統計學差異(P＜0.01)。 結論:1.HIF-1α基因能穩(wěn)定轉染人間充質干細胞并得到強制表達。 2.轉染HIF-1α基因的hMSCs，缺氧條件下細胞核內HIF-1α能穩(wěn)定存在；常氧條件下細胞核內HIF-1α不能穩(wěn)定存在，。表明利用轉基因hMSCs促進血管生成具有較好的可調控性。 3.轉染HIF-1α基因的hMSCs有明顯的促血管生成作用。 4.利用HIF-