柑橘轉錄因子CsCBF1和PtrNAC72在調控精氨酸脫羧酶基因表達及抗逆中的功能鑒定.pdf

1、柑橘是世界上栽培最廣、產(chǎn)量最高的水果作物，其中甜橙所占的比例最大，年產(chǎn)量約為柑橘類水果總產(chǎn)量的60％。甜橙喜溫不耐寒，因此低溫是限制柑橘產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一。多胺是含有兩個或兩個以上氨基的脂肪族化合物，參與植物生長發(fā)育、組織分化、果實成熟與衰老以及抵抗生物和非生物脅迫等重要生理過程，在一定程度內(nèi)，多胺在細胞中的積累量越多，其脅迫抗性越強。而在逆境脅迫下多胺合成酶基因表達量的上調是多胺在細胞中積累的前提，因此，研究多胺在低溫下的調控機理

2、和抗性機制對于增強甜橙抗性具有十分重要的作用。而在轉錄水平上的調控是高等植物基因表達的重要調控途徑，因此分析多胺合成酶基因脅迫應答網(wǎng)絡，鑒定多胺合成酶基因的轉錄調控因子能在植株抗逆遺傳改良上起到至關重要的作用。本研究主要結果如下:
　　1.甜橙多胺合成酶基因的鑒定及表達分析。
　　在甜橙中共鑒定出了10個多胺合成酶基因，分別為精氨酸脫羧酶(ADC)，亞精胺合成酶（SPDS1，SPDS2），精胺合成酶(SPMS)，S-腺苷甲硫

3、氨酸脫羧酶（SAMDC1，SAMDC2，SAMDC3，SAMDC4），熱精胺合成酶(ACL5-1，ACL5-2)。它們分布在甜橙的6條染色體上。上述基因在根中表達量較高，在果皮和果實上表達量較低。在腐胺處理下，大多數(shù)多胺合成酶基因呈下調趨勢;在亞精胺處理下，ADC，SPDS2，SAMDC4呈上調趨勢，其余基因表達量下調;在精胺處理下則相反。在不同組織中和不同脅迫處理下多胺合成酶基因表達模式差別較大，SPDS1，SAMDC3和SAMDC4

4、響應低溫脅迫，SAMDC2，ACL5-2受脫落酸(ABA)處理的誘導，其余基因受高鹽脅迫的誘導。而在葉片中，主要是ADC和SAMDC4響應低溫脅迫。低溫下不同甜橙組織多胺的變化模式也不同。甜橙葉片中腐胺上升最為明顯，而愈傷中精胺上升顯著。脅迫表達分析和腐胺含量的變化表明ADC是響應低溫脅迫的主要基因。
　　2.低溫脅迫下CsCBF1誘導ADC基因表達和腐胺合成。
　　CBFs轉錄因子在低溫信號轉導途徑中扮演了重要作用。低溫脅

5、迫下，CBFs基因全部被誘導表達，其中CBF2，CBF3誘導倍數(shù)最高;高鹽脅迫下，CBF3表達量上調;ABA處理后，只有CBF4表達量沒有明顯變化。在四個CBFs中，CBF1能與ADC啟動子結合并能夠誘導其表達。在甜橙和擬南芥CsCBF1超表達系中，ADC表達量升高，內(nèi)源腐胺合成增多，低溫抗性增強。實驗結果表明CsCBF1在ADC基因表達和腐胺合成中扮演著正向調控因子的作用。
　　3.干旱脅迫下PtrNAC72抑制ADC基因表達和

6、腐胺合成。
　　在前期實驗中，以ADC的啟動子為誘餌(bait)，采用酵母單雜交技術從枳cDNA文庫中篩選出了一個新的轉錄因子PtrNAC72。PtrNAC72定位在細胞核中，其相對不保守的C端具有轉錄活性。PtrNAC72能特異性地結合在ADC啟動子上的CCGAC順式作用元件，而且GUS染色證明PtrNAC72是一個轉錄抑制因子。在擬南芥nac72突變體中腐胺含量顯著升高，恢復系中和野生型相似，但明顯低于突變體。說明PtrNAC

7、72能夠抑制ADC基因的表達和腐胺的合成。PtrNAC72煙草超表達系脫水和干旱脅迫抗性降低，體內(nèi)抗氧化酶活性降低，活性氧積累量升高。而超表達系在外施腐胺后，恢復了其內(nèi)源腐胺含量和干旱脅迫的抗性。實驗結果表明PtrNAC72在ADC基因表達和腐胺合成中扮演著反向調控因子的作用。
　　在本研究中，在甜橙數(shù)據(jù)庫中共鑒定了10個不同的多胺合成酶基因，通過表達量分析及低溫下多胺含量的變化得出精氨酸脫羧酶ADC是響應脅迫的主要基因。隨后分別