基于多基因型戊型肝炎病毒混合抗原的ELISA IgM抗體捕獲法的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、[目的]HEV IgM抗體是急性戊型肝炎的診斷指標(biāo),目前其檢測(cè)方法的靈敏度和特異性急需提高.該實(shí)驗(yàn)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記多基因型HEV混合重組抗原,建立HEV ELISAIgM抗體捕獲法,以便為戊型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供簡(jiǎn)便、靈敏、有效的檢測(cè)手段.[方法]1.以人IgM為抗原免疫小鼠,取免疫脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合.細(xì)胞融合后將抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆,建立細(xì)胞株.小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法制備抗人IgM單克隆抗體,辛

2、酸—硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化.2.將7種不同基因型和亞型的HEV重組抗原等量混合,過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記,硫酸銨鹽析法純化酶標(biāo)記混合物,對(duì)酶標(biāo)抗原進(jìn)行質(zhì)量鑒定.3.用方陣滴定法在已制備的抗人IgM單克隆抗體中選擇包被抗體,并確定最佳抗體包被稀釋度和酶標(biāo)抗原稀釋度,選擇合適的包被液、標(biāo)本稀釋液、酶標(biāo)抗原稀釋液、標(biāo)本稀釋度,建立HEVIgM抗體捕獲法,并對(duì)其敏感性、特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià).[結(jié)果]1.獲得三株分泌抗人IgM單克隆抗體的雜交瘤

3、細(xì)胞株:M<,1>、M<,2>、M<,3>,其分泌的單克隆抗體經(jīng)亞類鑒定分別為IgG3、IgG2a和IgG1;將腹水抗體純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,在分子量為55KD和25KD處有蛋白帶,沒(méi)有雜蛋白條帶.2.HEV混合抗原辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記后工作濃度為1:800;質(zhì)量鑒定:HRP含量=0.42mg/ml;HEVAg含量=0.34mg/ml;酶/抗原摩爾比=1.4:1.3.選用單克隆抗體M<,3>為包被抗體建立IgM抗體捕獲法,并對(duì)

4、其進(jìn)行評(píng)價(jià):①特異性捕獲HEV IgM抗體的證據(jù):檢測(cè)3只實(shí)驗(yàn)感染非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物系列血清,均能檢測(cè)到HEV IgM抗體陽(yáng)轉(zhuǎn),抗體滴度達(dá)高峰后逐漸降低,至轉(zhuǎn)陰,而此時(shí)HEV IgG抗體仍維持在較高滴度;10份陽(yáng)性標(biāo)本DTT處理后檢測(cè)結(jié)果全部陰性.②敏感性和特異性:用該方法檢測(cè)37份HEV RT-nPCR陽(yáng)性的肝炎病人血清,結(jié)果全部陽(yáng)性;檢測(cè)采集自7個(gè)國(guó)家的血清標(biāo)本,與美國(guó)CDC檢測(cè)結(jié)果比較,總檢出符合率為100％;分別檢測(cè)5份HAV陽(yáng)性、

5、8份HBV陽(yáng)性和12份HCV陽(yáng)性血清標(biāo)本,結(jié)果全部陰性.③檢測(cè)291份門診血清標(biāo)本,與Genelabs公司試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較,符合率為94.5％,但有3份標(biāo)本進(jìn)口試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性,該方法未檢出,13份標(biāo)本該方法檢測(cè)為陽(yáng)性,進(jìn)口試劑盒未檢出,這13份標(biāo)本進(jìn)一步以HEV RT-nPCR檢測(cè),得到2份陽(yáng)性,HEV抗原中和實(shí)驗(yàn)全部陽(yáng)性,說(shuō)明與Genelabs公司試劑盒相比,該方法檢出率更高;檢測(cè)48份血清標(biāo)本與該實(shí)驗(yàn)室用同樣抗原建立的ELISA一

6、步法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,檢出率相同,該方法具有陰性本底低、陽(yáng)性標(biāo)本OD值高的特點(diǎn),總之,該檢測(cè)方法靈敏度和特異性較好.④穩(wěn)定性:本試劑在4℃至少穩(wěn)定6個(gè)月,穩(wěn)定性較好.⑤重復(fù)性:批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10％,重復(fù)性較好.[結(jié)論]1.所制備的單克隆抗體M3能特異性地捕獲人血清中的IgM類抗體.2.用高純度和高效價(jià)的多基因型HEV混合重組抗原進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記,質(zhì)量符合要求,能夠用于建立HEV IgM抗體捕獲法.3.所建立的HE