機械牽張加重缺血缺氧心肌細胞損傷的效應及其機制研究.pdf

1、生物體本身處于外在的力學環(huán)境中,而生物體內部也保持著一種靜態(tài)或動態(tài)的力學相互作用.研究表明,外在物理力和內部應力對于細胞生長、形態(tài)維持和分化起到了重要的作用.其中細胞骨架介導的機械轉導是近年來的研究熱點.然而,上述研究多集中于機械因素對正常細胞的作用及其機理研究,病理條件下,特別是缺血缺氧條件下機械刺激的細胞效應及機制研究尚未見報道.正常情況下,心臟內血流使心肌充盈,心腔擴張,對心肌產(chǎn)生一定的牽張刺激.嚴重燒傷早期由于缺血缺氧與炎癥反應

2、失控即發(fā)生了器質性心肌損害.此時血容量的減少以及過多過快補液所造成的血容量迅速增加等血液動力學的急劇變化使心肌細胞所受到的牽張刺激發(fā)生變化.牽張刺激的變化對于業(yè)已存在的心肌損害有何影響尚不清楚.顯然,研究這種病理條件下心肌損害的發(fā)生機理更具有直接意義.臨床研究表明,燒傷補液后血液中心肌酶含量較補液前顯著上升,表明補液后心肌損害進一步加重,其機制卻不甚明了.同時,由于目前對于防治"休克心"缺乏有效的治療手段都促使我們進一步研究其發(fā)病機理并

3、尋找新的干預手段.由于細胞骨架在信號轉導、特別是機械轉導中的重要作用,我們推測其可能在"休克心"的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用.為了驗證上述設想,我們設計了如下實驗:一、研究目的:明確機械牽張加重缺血缺氧對離體培養(yǎng)的心肌細胞的損傷效應,探討細胞骨架(微絲、微管)在其中的作用及機制.二、材料方法:1. 采用離體培養(yǎng)的大鼠心肌細胞,建立機械牽張模型,從細胞形態(tài)、培養(yǎng)液中LDH含量及心肌細胞PI染色陽性率等幾個方面明確機械牽張對心肌細胞的影響.2

4、. 利用模型進一步施加缺血缺氧因素,分別檢測10﹪牽張、缺血缺氧、10﹪牽張+缺血缺氧三組細胞在1、3、6、12h不同時相點細胞形態(tài)(免疫熒光)、培養(yǎng)液LDH含量、TNF-αmRNA(RT-PCR)、MHCmRNA(RT-PCR)、PI染色陽性率的變化.3.分別檢測10﹪牽張、缺血缺氧、10﹪牽張+缺血缺氧三組細胞在不同時相點微管、微絲蛋白含量(Western Blotting)及形態(tài)的變化(激光共聚焦顯微鏡).4. 檢測細胞骨架穩(wěn)定劑

5、taxol或(和)phalloidin對10﹪牽張+缺血缺氧組心肌細胞形態(tài)民、培養(yǎng)液LDH含量、TNF-αmRNA(RT-PCR)、MHCmRNA(RT-PCR)、PI染色陽性率的影響.三、主要結果:1. 通過比較、設計、調整,成功建立了心肌細胞體外牽張刺激模型.該模型具有制作方便、操作簡單、易于觀察的優(yōu)點.大鼠心肌細胞在硅酮膜上生長狀態(tài)良好.培養(yǎng)液中LDH含量及心肌細胞PI染色與正常對照組無明顯差別.心肌細胞的進一步鋪展及偽足的大量出

6、現(xiàn)..2. 與正常對照、10﹪牽張組和缺血缺氧組比較,10﹪牽張+缺血缺氧組心肌細胞有以下明顯不同:LDH升高異常明顯,呈現(xiàn)爆發(fā)性升高特點,各個時相點均顯著高于正常組 (P<0.01) ,且與其它各組比較均明顯增高 (P<0.01) ;TNF-αmRNA表達上升明顯,增幅高于缺血缺氧組;β-MHC mRNA于表達峰提前,3h即達高峰,其后迅速降低,12h時與缺血缺氧組相比有明顯下降;PI染色陽性心肌細胞比例明顯增加.3. 正常非肌節(jié)型微

7、絲在細胞內呈現(xiàn)相互交錯網(wǎng)絡狀分布,受到機械牽張后表現(xiàn)為蛋白含量增加及發(fā)生與受力方向相關的重排;缺血缺氧后出現(xiàn)破壞,隨時間延長破壞加劇;10﹪牽張+缺血缺氧刺激后細胞骨架破壞明顯加速,表現(xiàn)在蛋白含量急劇下降及形態(tài)破壞加劇.微管呈現(xiàn)類似變化趨勢,但其變化更加劇烈.4. 以微絲穩(wěn)定劑taxol或(和)微管穩(wěn)定劑phalloidin對10﹪牽張+缺血缺氧組心肌細胞進行干預后,各組細胞培養(yǎng)液中LDH含量、PI染色陽性率明顯下降,MHCmRNAα型

8、相對表達量下降減慢及β型波動減小.穩(wěn)定微管后TNF-αmRNA上升趨勢明顯減弱.四、討論:1. 設計了一種簡單、經(jīng)濟、易行的單軸靜態(tài)機械細胞牽張裝置,實現(xiàn)了對缺血缺氧這一病理生理條件下心肌細胞的機械牽張.利用所建立的模型證實了10﹪的機械刺激強度在心肌細胞正常的生理范圍之內,對于細胞無急性損傷效應.10﹪牽張12h后細胞的進一步鋪展、偽足增多進一步提示了細胞功能活躍,結合其它文獻一致說明了適度的機械刺激是一種正性刺激.2. 通過與正常組

9、、10﹪牽張組和缺血缺氧組的比較,可以看出機械牽張+缺血缺氧組心肌細胞損傷最為嚴重.表現(xiàn)在:形態(tài)破壞的加劇,加重缺血缺氧對心肌細胞膜的損傷,加劇缺血缺氧對心肌細胞炎癥相關基因的上調以及加劇缺血缺氧對心肌細胞收縮蛋白基因表達的負性調節(jié).這就提示機械牽張加重了缺血缺氧對心肌細胞的損傷效應.3. 10﹪牽張能夠顯著增強缺血缺氧對心肌細胞微管、微絲的破壞作用,表現(xiàn)在微絲的斷裂及蛋白含量的減少.可能與隨著缺血缺氧造成能量潰乏時間的延長,細胞骨架對

10、機械刺激的耐受減弱,造成此時機械牽張對骨架的破壞加劇有關.同時,這也進一步證實了機械牽張加重缺血缺氧心肌細胞損傷的效應.4. 微絲穩(wěn)定劑taxol或(和)微管穩(wěn)定劑phalloidin對10﹪牽張+缺血缺氧組心肌細胞進行干預后,該組心肌細胞損傷程度明顯減輕,說明穩(wěn)定細胞骨架能夠有效的減弱10﹪牽張對缺血缺氧心肌細胞的損傷效應.上述效應可能與較好的維持細胞形態(tài)、減輕細胞內鈣超載、抑制NF-ΚB的活化等有關.5.該模型較好的模擬了嚴重燒傷后