核孔蛋白與核磷蛋白——天然藥物治療急性白血病的新型分子靶點.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分、魚藤素對Jurkat 白血病細胞核孔蛋白與核磷蛋白的調節(jié)作用 目的：研究魚藤素對白血病細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機理，為其臨床應用提供理論基礎。 方法：以人類T 淋巴細胞白血病細胞系Jurkat 作為研究對象，采用MTT 法檢測細胞增殖活性；DNA ladder 法、Hoechst33258 染色法和Annexin V-FITC/PI 雙標法檢測細胞凋亡；流式細胞術、W

2、estern Blot、RT-PCR 檢測魚藤素作用前后，Jurkat細胞內核孔蛋白Nup88、Nup214 與核磷蛋白(nucleophosmin，NPM)表達水平的變化；激光共聚焦顯微技術觀察上述核孔蛋白與核磷蛋白的亞細胞定位情況。 結果：（1）魚藤素以劑量、時間依賴性方式抑制Jurkat細胞的增殖，其24 h的IC50是46.03±0.13 nmol/L。（2）魚藤素以劑量依賴性方式誘導Jurkat細胞凋亡，40 nmol

3、/L的魚藤素處理24 h 后出現(xiàn)明顯的DNA 剪切現(xiàn)象，伴有典型的凋亡細胞形態(tài)學改變，其總凋亡率達(19.87±1.76)％。（3）魚藤素能同時在蛋白和基因水平，以劑量依賴性方式抑制核孔蛋白Nup88、Nup214 以及核磷蛋白NPM的表達。 結論：魚藤素能明顯抑制Jurkat細胞增殖，并誘導其凋亡。其抗白血病效應可能與其下調核孔蛋白Nup88、Nup214 以及核磷蛋白NPM的表達有關。 第二部分、藤黃酸對白血病細胞的

4、增殖、凋亡和細胞周期的影響 目的：研究藤黃酸對人類多種白血病細胞系的體外抗腫瘤作用。 方法：以HL-60（人急性粒細胞白血病細胞株）；U937（人急性單核細胞白血病細胞株）；K562（人慢性髓系白血病急變細胞株）為研究對象，采用MTT 法檢測藤黃酸對三種白血病細胞系增殖活性的影響；Hoechst33258 染色法和AnnexinV-FITC/PI 雙標法檢測細胞凋亡；PI 單染色法測定藤黃酸對三種白血病細胞系增殖周期的影

5、響。 結果：（1）藤黃酸對HL-60、U937、K562 三種白血病細胞系均具有明顯的抑制增殖作用。其中，HL-60細胞最為敏感，而K562細胞對藤黃酸的敏感性相對較差。（2）藤黃酸均能誘導HL-60、U937、K562細胞發(fā)生不同程度的凋亡，呈明顯的劑量依賴性。其中，HL-60 對藤黃酸尤為敏感，經1.6 μmol/L的藤黃酸干預12 h 后，一半以上的HL-60細胞發(fā)生早期凋亡，其總凋亡率高達(77.84±2.38)％；而藤

6、黃酸對U937和K562細胞的誘導凋亡作用相對較弱。（3）藤黃酸對三種白血病細胞系的周期調控作用并不完全一致，U937和K562細胞經藤黃酸誘導后被阻滯于G0/G1期，S期細胞相應減少；相對而言，HL-60細胞的增殖周期并不受藤黃酸干預的影響，即使在出現(xiàn)顯著細胞凋亡峰的情況下，仍未見明顯的細胞周期的改變。 結論：藤黃酸對多種白血病細胞系均有抑制細胞增殖、誘導凋亡的作用。其中，HL-60細胞對藤黃酸的抗白血病效應最為敏感。此外，藤

7、黃酸也不是對所有白血病細胞均有誘導周期阻滯作用，HL-60細胞可能在其發(fā)生周期阻滯前即已凋亡。推測藤黃酸的抗白血病效應在不同細胞系中存在較大差異。 第三部分、藤黃酸對Jurkat 白血病細胞核孔蛋白與核磷蛋白的調節(jié)作用 目的：研究藤黃酸對白血病細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機理，為其臨床應用提供理論基礎。 方法：以人類T 淋巴細胞白血病細胞系Jurkat 作為研究對象，采用MTT 法檢測細胞增殖活性；H

8、oechst33258 染色法和Annexin V-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡；流式細胞術、Western Blot、RT-PCR、檢測藤黃酸作用前后，Jurkat細胞內凋亡調控蛋白Bcl-2、Bcl-xL、核孔蛋白Nup88、Nup214、Nup98 與核磷蛋白NPM的表達水平；免疫細胞化學染色法和激光共聚焦顯微技術觀察核孔蛋白與核磷蛋白的亞細胞定位情況。 結果：（1）藤黃酸以時間、劑量依賴性方式抑制Jurkat細胞增殖

9、，其24 h的IC50為1.822±0.148 μmol/L。（2）藤黃酸以劑量依賴性方式誘導Jurkat細胞凋亡，伴有典型的凋亡細胞形態(tài)學改變。此外，凋亡調控蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達也隨之減少。（3）藤黃酸以劑量依賴性方式下調Jurkat細胞內核孔蛋白Nup88、Nup214、Nup98 與核磷蛋白NPM的表達水平。核孔蛋白Nup88 與Nup214的亞細胞定位經藤黃酸干預后也發(fā)生了細微的變化。 結論：藤黃酸能夠抑制