脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)小鼠成骨細(xì)胞RUNX2基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討小鼠成骨細(xì)胞的兩種原代培養(yǎng)方法。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠成骨細(xì)胞的周期和凋亡，探討脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)對(duì)小鼠成骨細(xì)胞的毒性作用；檢測(cè)DON毒素對(duì)小鼠成骨細(xì)胞Runx2基因表達(dá)情況的影響；為進(jìn)一步研究真菌毒素造成骨骼發(fā)育不良及畸形的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 方法：采用組織塊法和膠原酶分段消化法，從乳鼠的頂骨及顱骨中培養(yǎng)原代細(xì)胞。采用茜素紅、堿性磷酸酶染色法鑒定。用不同濃度的DON(

2、0，100，500，1000ng/ml)分別作用于小鼠成骨細(xì)胞24小時(shí)。使用PI單染后，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DON對(duì)細(xì)胞周期分布的影響；AV-PI雙染后，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢DON對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。提取細(xì)胞總RNA，采用半定量PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Runx2基因在不同濃度DON毒素的影響下的表達(dá)趨勢(shì)。
　　 結(jié)果：⑴原代培養(yǎng)及鑒定兩種原代培養(yǎng)方法均能成功獲得小鼠成骨細(xì)胞。通過(guò)組織塊培養(yǎng)法得到的原代細(xì)胞量少，耗時(shí)長(zhǎng)，但純

3、度較高；通過(guò)Ⅱ型膠原酶分段消化法得到的原代細(xì)胞數(shù)量多，耗時(shí)短，但雜細(xì)胞較多，需純化。茜素紅、堿性磷酸酶染色結(jié)果為陽(yáng)性，證實(shí)所取原代細(xì)胞為成骨細(xì)胞。⑵DON對(duì)細(xì)胞周期的影響通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示，在不同濃度DON的影響下，成骨細(xì)胞增周期分布出現(xiàn)變化。其中100ng/ml、200ng/ml組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞周期分布差異不明顯，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)DON濃度在500ng/ml以上時(shí)，與空白對(duì)照組的區(qū)別顯著。500ng/mlDON作

4、用于細(xì)胞時(shí)，S期細(xì)胞的比例開(kāi)始增多，G2/M期細(xì)胞的比例開(kāi)始減少。1000ng/ml組DON作用于細(xì)胞時(shí)，S期細(xì)胞比例明顯增多，G2/M期細(xì)胞比例明顯減少。細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯，可能與DNA合成受到抑制有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明DON可影響小鼠成骨細(xì)胞周期分布，具有明顯的抗增殖作用。⑶DON對(duì)細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果分析顯示，不同濃度的DON毒素作用于小鼠成骨細(xì)胞24小時(shí)后，隨DON濃度的增加，細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡均呈現(xiàn)增加的趨

5、勢(shì)。100ng/ml、200ng/ml組早期凋亡和晚期凋亡與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。500ng/ml組作用于細(xì)胞時(shí)，UR、LR象限細(xì)胞比例上升，凋亡率開(kāi)始增加。800ng/ml、1000ng/ml組UR、LR象限細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞發(fā)生凋亡率增加顯著。說(shuō)明DON可誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率與使用的DON濃度正相關(guān)。⑷DON對(duì)Runx2基因表達(dá)的影響半定量PCR結(jié)果顯示：凝膠上200-300bp之間出現(xiàn)亮度基本均一的內(nèi)參條

6、帶，300-400bp之間出現(xiàn)亮度逐漸降低的目的條帶。在內(nèi)參條帶亮度一致的條件下，目的基因條帶的亮度隨DON濃度的增加，亮度逐漸降低。說(shuō)明隨著DON的增加，由Runx2轉(zhuǎn)錄的mRNA的含量逐漸減少。⑸熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：各組內(nèi)參Ct值基本一致。各實(shí)驗(yàn)組Runx2基因表達(dá)量與空白對(duì)照組的關(guān)系為：100ng/ml組約為空白對(duì)照組的72.8％，500ng/ml組約為空白對(duì)照組的60.9％，1000ng/ml組約為