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文檔簡介
1、目的：1.利用人乳頭瘤病毒(HPV)主要結構蛋白Ll能自組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)并可作為抗原釋放載體的特點,構建HPV6b11/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位的重組DNA,并在真核表達系統(tǒng)昆蟲細胞s19內表達該嵌合蛋白,為進一步研究其免疫原性、制備胃腸腫瘤嵌合蛋白疫苗奠定了基礎. 2.將MAGE-A3、CEA691、Her-2的CTL表位DNA克隆至優(yōu)化后的HPV6b11基因羧基端,構建優(yōu)化HPV6b
2、11/MAGE-3,CEA691/Her-2 CTL表位的重組DNA,并真核表達系統(tǒng)Cos-7細胞內檢測其表達情況,為研究優(yōu)化后HPV L1載體表達情況及制備胃腸腫瘤核酸疫苗奠定了理論基礎. 方法：1.選擇pFastBac<'TM>/HPV6b11/MAGE-A3-CTL表位(MAGE-A3 899～924,氨基酸序列:YLEYRQVPG)重組質粒和CEA691-CTL表位(CEA691 2185～2212,氨基酸序列:IMIG
3、VLVGV)及Her-2 CTL表位(1278～1305,氨基酸序列:KIFGSLAFL),通過PCR擴增出HV6b11/MAGE-A3/CEA69l/Her-2 CTL表位重組DNA,克隆入pFastBac<'TM>載體,構建pFastBac<'TM>1/HPV6b L1/MAGE-A3/CEA691/Her-2-CTL表位重組質粒,轉化大腸桿菌DH10,構建Bacmid/HPV6bL1/MAGE-A3/CEA691/Her-2-CT
4、L表位重組桿狀病毒,將重組桿狀病毒轉染sf-9昆蟲細胞,表達嵌合蛋白,經SDS-PAGE電泳及Westem-blot分析鑒定正確,超離純化出嵌合蛋白.2.選擇密碼子的優(yōu)化HPV6BL1、MAGE-A3 CTL表位(MAGE-A3 899-924,氨基酸序列:YLEYRQVPG)、CEA CTL表位(CEA691位于2185-2212,氨基酸序列:IMIGVLVGV)和Her-2 CTL表位(Her-2/neu 1278-1305,氨基酸
5、序列:KIFGSLAFL),通過PCR擴增出優(yōu)化HPV6b11/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組DNA,克隆入pCDNA3.1載體,構建pCDNA3.1/優(yōu)化HPV6b11/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL細胞表位重組質粒,轉染Cos-7細胞,經SDS-PAGE電泳及Western-blotting分析重組質粒的表達情況. 結果：1.成功構建了HPPV6bl1,MAGE-A3,CEA691
6、/Her-2 CTL表位重組DNA采用PCR成功擴增出HPV6bl1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組DNA,成功構建pFas<'TM>tBacTM1/HPV6bL1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組質粒和Baemid/HPV6bL1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組桿狀病毒.2.成功制備了HPV6bl1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位嵌合蛋白
7、重組桿狀病毒成功轉染sf9細胞,SDS-PAGE電泳及Western-blot分析能構表達63kd大小.3.超速離心分離純化出目的HPV6bl1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位嵌合自.4.成功構建pCDNA3.1/優(yōu)化HP6bl1/MAGBE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組質粒,轉染Cos-7細胞后,經SDS-PAGE電泳及Westem-blot分析,重組質粒能夠在真核細胞內表達蛋白. 結論
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