非抗性篩選KISS1基因疫苗構(gòu)建及其免疫效果的研究.pdf

1、吻素（KISS1）通過控制下丘腦GnRH神經(jīng)元分泌GnRH調(diào)控生殖軸，進(jìn)而在動(dòng)物繁殖功能方面起到至關(guān)重要的開關(guān)作用。KISS1基因已經(jīng)被證明能夠作為基因免疫去勢(shì)良好的靶標(biāo)。前期試驗(yàn)采用質(zhì)粒肌肉注射的方式接種公羔取得了較為理想的去勢(shì)效果，但是質(zhì)粒的制備存在繁瑣和價(jià)格較高等問題。因此，需要構(gòu)建一種制備簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)的新型KISS1基因疫苗。
　　本研究將前期構(gòu)建的pVAX-KISS1-S-asd真核表達(dá)質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入減毒豬霍

2、亂沙門氏菌C500中，經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定挑選陽(yáng)性克隆，命名為C500/pKS-asd;將重組菌C500/pKS-asd在無(wú)菌的條件下連續(xù)接種50次，提取質(zhì)粒和細(xì)菌基因組DNA，通過質(zhì)粒雙酶切和沙門氏菌屬中保守InvA基因序列的PCR擴(kuò)增鑒定重組真核表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的傳代穩(wěn)定性。用C500/pKS-asd和C500/pVAX-asd重組菌通過滴鼻方式分3次免疫10只10周齡的公羔，每次間隔4周，劑量為2×1010CFU/只，每隔兩周采集血

3、樣和測(cè)量陰囊周長(zhǎng);初次免疫后14周屠宰試驗(yàn)羊，采集組織樣和血樣。用ELISA的方法檢測(cè)血清中的抗體和生殖激素;用HE染色的方法制作睪丸切片;用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析對(duì)照組與試驗(yàn)組公羊中下丘腦-垂體-睪丸軸上相關(guān)生殖基因相對(duì)表達(dá)量的差異。
　　結(jié)果表明，重組菌C500/pKS-asd和重組真核表達(dá)質(zhì)粒均具有良好的傳代穩(wěn)定性。試驗(yàn)組從初次免疫后第4周至14周檢測(cè)到抗體水平逐次增高。試驗(yàn)組睪酮激素濃度呈降低趨勢(shì)，在初次免疫后第8周

4、至12周顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。陰囊周長(zhǎng)從初次免疫后第2周至14周也均低于對(duì)照組(P＞0.05)。初次免疫后第12-14周試驗(yàn)組公羊性行為表現(xiàn)（嗅聞、爬跨和頂撞頻率）明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。初次免疫后第14周屠宰時(shí)試驗(yàn)組公羊的睪丸大?。ㄩL(zhǎng)度、寬度和體積）和重量均顯著低于對(duì)照組睪丸(P＜0.05);同時(shí)睪丸HE組織學(xué)檢測(cè)顯示試驗(yàn)組公羊睪丸曲細(xì)精管管腔內(nèi)（生精小管ST）的精原細(xì)胞和精子產(chǎn)生量明顯少于對(duì)照組，各級(jí)生殖細(xì)胞之間較

5、為模糊，排列松散。試驗(yàn)組下丘腦中KISS1 mRNA和GPR54 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，試驗(yàn)組垂體中GPR54 mRNA、GnRHR mRNA和LHβ mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，試驗(yàn)組睪丸中AR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　本研究成功構(gòu)建了非抗性篩選CS00/pVAX-KISS1-S-asd重組菌，菌株和質(zhì)粒傳代都很穩(wěn)定;公羔通過滴鼻方式接種CS00/