人RhoGDI2的7個定點突變體的活性研究及其在人乳腺癌中的表達模式分析.pdf

1、RAS GTP酶超家族參與了很多細胞過程，包括細胞生長的控制，基因表達，細胞骨架的重排，微管的組織，膜泡和核的轉運，細胞的生存以及細胞內的信號調節(jié)等過程，它們和人類的多種疾病特別是惡性腫瘤相關。RAS超家族共分成五個亞家族，它們分別是Ras，Rho，Rab，Ran和Arf。其中Rho亞家族GTP酶參與了細胞骨架的構建，基因表達和酶活性的調節(jié)等很多關鍵步驟。它們和其它RAS超家族的成員一樣，通過結合GTP或者GDP而起到分子開關的作用。當

2、形成GTP結合狀態(tài)時Rho GTP酶處于活性狀態(tài)，而和GDP結合時則處于非活性狀態(tài)。Rho GTP酶在這兩種狀態(tài)之間的轉換依賴于一些調節(jié)因子。RhoGDIs (Rho GDP-Dissociation Inhibitors，Rho GTP酶的GDP解離抑制因子)是其中一類非常關鍵的調節(jié)因子。RhoGDIs的主要功能是抑制GDP從Rho GTP酶上解離下來，使后者處于非活性狀態(tài)。 Rho GTP酶在Rho-ROCK，JNK等信號途

3、徑中起著關鍵的作用。因此，它們在活性和非活性兩種狀態(tài)之間的平衡顯得非常重要。已經(jīng)有大量的實驗證明，RhoGTP酶(如RhoC，RhoA，Rac1，CDC42等)的過度表達和活化會啟動基因轉錄，促進細胞分裂，導致細胞生長和遷移的能力大大增強，從而使細胞發(fā)生癌變。另外一些研究表明，在休眠的細胞中，大部分Rho GTP酶處于GDP結合的非活性狀態(tài)，在細胞質中以和RhoGDIs形成復合物的形式存在。由此可見，Rho GTP酶維持在非活性狀態(tài)對于

4、細胞維持正常的生理和生物學功能很關鍵。 RhoGDI2是RhoGDIs家族的一個成員，它作為Rho GTP酶關鍵的活性調節(jié)因子之一，也得到了人們普遍的重視。近年來人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RhoGDI2和腫瘤的發(fā)生和轉移有關。Gildea等在2002年底第一次發(fā)現(xiàn)并用實驗證明了在人類膀胱癌中RhoGDI2起抑制腫瘤轉移的作用，引起了人們極大的關注。但是該基因和腫瘤的關系從目前看來還很撲朔迷離。有些研究認為RhoGDI2在乳腺癌，人骨肉瘤細胞癌

5、，口腔上皮癌和卵巢癌中表達升高，張等在2006年6月發(fā)現(xiàn)RhoGDI2在乳腺癌中促進了腫瘤浸潤。而另外一些研究則證明RhoGDI2可以在膀胱癌和直腸癌細胞株中起到抑制腫瘤轉移的功能。RhoGDI2和腫瘤之間關系的研究才剛剛起步，越來越多的人對這個基因發(fā)生興趣。 本文中我們首先根據(jù)已有RhoGDI2的文獻以及晶體結構分析的報道，挑選了7個可能和RhoGDI2的GDP解離抑制因子功能相關的位點，采用體外定點突變的方法，分別制備了7個

6、不同的RhoGDI2定點突變體。體外表達純化野生型RhoGDI2和定點突變體蛋白質后，分別檢測了它們和RhoA的結合能力，以及它們抑制RhoA的GDP解離的功能的變化。和RhoA的結合實驗表明，其中一個突變體LL(52，53)SS和RhoA的結合能力明顯下降，其它6個突變體的結合能力則沒有明顯的降低。GDP解離抑制實驗的結果顯示所得到的7個定點突變體的GDP解離抑制能力下降都很明顯。最為突出的是SL(44，45)AA，LL(52，53)

7、SS，DD(181，182)從，這三個定點突變體的GDP解離抑制功能幾乎完全消失。RhoGDIs家族的保守性非常高，因此這個結果可能提示我們，RhoGDI2蛋白質活性對其氨基酸序列和空間結構的要求很嚴格，故某些甚至1個重要位點發(fā)生突變都易導致其功能的減弱或消失。另外，為了了解RhoGDI2與乳腺癌的相關性，我們在5個轉移能力不同的乳腺癌細胞株和71例乳腺癌病人組織中檢測了RhoGDI2蛋白質的表達水平。腫瘤組織切片的免疫組化和細胞學研究

8、的結果一致表明RhoGDI2的表達隨著細胞從正常到轉移這一系列過程中呈現(xiàn)出先升高后降低的現(xiàn)象。表明該基因和人乳腺癌的發(fā)生和轉移可能都有關系。 此外，在20例腫瘤新鮮組織中，我們用半定量RT-PCR的方法初步探索了包括RhoC，CDC42，Rac2和Rac3在內的4種Rho GTP酶的表達變化。比較了每一例病人正常和腫瘤組織中各種Rho GTP酶的表達水平的差異后，發(fā)現(xiàn)RhoC在腫瘤組織中的表達要明顯高于正常組織(87.5％)，這

9、和文獻報道的結果一致。Rac2和CDC42的表達在我們的初步檢測中并未發(fā)現(xiàn)有明顯的規(guī)律。然而，我們發(fā)現(xiàn)Rac3在17例腫瘤組織中的表達升高非常明顯。從Rac3獲得的初步結果提示我們這個基因也許可以成為檢測腫瘤的marker和治療腫瘤的靶點之一，值得做進一步的研究。 RAS家族是個巨大的家族，已有很多研究表明這個家族的成員和腫瘤的發(fā)生和轉移相關。我們在搜索NCBI數(shù)據(jù)庫時發(fā)現(xiàn)了一個未被鑒定過的RAS基因RasL10B。生物信息學分

10、析提示我們該基因極可能和腫瘤抑制相關。因此我們從人白細胞cDNA文庫中分離和鑒定了這個基因，做了一些初步的功能分析，并在正常乳腺細胞株和乳腺癌細胞株中檢測和比較了RasL10B mRNA的表達水平。結果顯示，RasL10B定位于染色體17q12，編碼203個氨基酸，分子量大約為23.2 kD。我們將其編碼區(qū)克隆到大腸桿菌表達質粒pET30a中，在大腸桿菌Rosette(DE3)中表達了RasL10B蛋白質后，用His-tag親和層析柱純

11、化得到少量純化的蛋白質，為以后的研究做了一些材料和方法上的摸索。人的7種組織表達譜分析表明，RasL10B在這些組織中廣泛表達，但是表達量有差別，其中大腦，胰，胸腺和前列腺組織中表達較高。 COS7細胞的亞細胞定位結果表明，該蛋白質主要定位在細胞質中。最后，我們在人類乳腺癌細胞株MCF-7，MDA-MB-468，MDA-MB-231和MDA-MB-435中和正常的乳腺細胞株HBL100中用半定量RT-PCR的方法檢測了RasL1