基于差示掃描量熱法和蛋白質組學技術尋找腦脊液中膠質瘤惡性程度相關的生物學標志物.pdf

1、目的:在成人中樞神經系統(tǒng)(central nervous system，CNS)各種原發(fā)性腫瘤中，以膠質瘤(glioma)最常見是，約占60％，其中惡性程度最高的膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)又占全部膠質瘤的一半以上。GBM生物學上呈現侵襲性生長，手術無法全切。即便予以最大安全程度切除，輔助以放、化療，腫瘤從原發(fā)灶復發(fā)幾乎無法避免，患者復發(fā)率和死亡率仍很高。膠質瘤惡性程度特異性生物學標志物，被認為有望協(xié)助神經腫瘤醫(yī)生早

2、期、有效地診斷膠質瘤，監(jiān)測治療反應，預警復發(fā)，甚至用于開發(fā)膠質瘤患者的個體化治療方案，因此是目前神經外科領域的研究熱點之一。而腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)因為其特殊的生理位置與生物學功能，一直是尋找中樞神經系統(tǒng)疾病相關生物學標志物的重要樣本來源。本課題的目的是通過比較不同惡性程度膠質瘤患者來源的CSF蛋白質組的改變，從宏觀的物理學熱穩(wěn)定特征，到微觀上的高豐度和低豐度蛋白質組成分，嘗試尋找與膠質瘤惡性程度相關的

3、生物學標志物，為后續(xù)臨床研究和轉化奠定一定的實驗室基礎。
　　方法:在第一部分，我們選用了39例患者來源的樣本，包括36個CSF樣本和3個GBM腫瘤囊腫液樣本，對其進行超濾濃縮、換鹽、蛋白定量等預處理后，采用現代高靈敏度的差示掃描量熱儀，分析膠質瘤CSF的蛋白質組在不同疾病狀態(tài)下整體熱穩(wěn)定性的改變，并通過ELISA的方法對CSF蛋白質組的高豐度組分進行定量，初步探討熱穩(wěn)定性改變的可能機制;DSC的優(yōu)點是快速簡便，對樣本預處理要求低

4、，但是其描述的熱力學參數僅是蛋白質組宏觀上整體的物理特征，尚缺乏微觀上，尤其是對疾病狀態(tài)下低豐度蛋白質成分改變的直接檢測能力，而以質譜技術為代表的蛋白質組技術平臺，能很好地彌補這個不足。因此在第二部分，我們首先從Pubmed檢索現有的基于膠質瘤CSF開展的蛋白質組研究工作，對它們進行系統(tǒng)綜述，對不同研究采用的研究方案進行總結與比較，并歸納各項研究發(fā)現的差異表達蛋白（潛在生物學標志物）。在此基礎上，通過應用PANTHER分類系統(tǒng)及IPA軟

5、件等在線生物信息學方法，探尋不同研究發(fā)現之間是否存在一定的內在聯系，并基于IPA網絡尋找新的潛在膠質瘤CSF標志物，最后用ELISA的方法在我們自己收集的29例患者來源的樣本中進行驗證;在第二部分文獻復習的基礎上，我們在第三部分研究中選用了44例患者來源的樣本，首先用ProteoMiner試劑盒去除其中的高豐度蛋白并富集低豐度蛋白，然后樣本通過過柱去鹽，Bradford法蛋白定量，酶切肽段等處理后，應用iTRAQ標記結合二維納升級反向液

6、相色譜-電噴霧串聯質譜技術，鑒定并相對定量分析樣本中的蛋白成分，并依據不同篩選條件得到差異表達蛋白。對這些差異表達蛋白，首先結合生物信息學分析及文獻檢索的方法，初篩獲得目前尚未在膠質瘤研究中報道的新的蛋白分子，然后用ELISA的方法在膠質瘤患者CSF中驗證其組間差異表達的存在，最后在新收集的6例CSF中驗證用這些差異蛋白去鑒別膠質瘤惡性程度的可靠性。除此之外，我們還收集了5例GBM組織的原代細胞上清和9種惡性腫瘤細胞系上清，后者包括4種

7、人GBM細胞系，2種膠質瘤細胞系和3種非膠質瘤腫瘤細胞系，用ELISA的方法對鑒定到的新蛋白進行檢測，探討這些差異蛋白可能的來源。
　　結果:在第一部分，我們發(fā)現非腫瘤對照組CSF的DSC曲線，其主要轉變溫度或熔解溫度(melting temperature，Tm)是在73.2℃，與之相比，良性腦腫瘤組與低級別膠質瘤組的Tm值分別升高到了73.8℃和74.1℃，而GBM組的Tm值升高最為明顯(75.6℃)，統(tǒng)計學分析發(fā)現GBM組與

8、其它組之間的差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。進一步檢測樣本總蛋白濃度后發(fā)現，來自GBM患者的CF樣本顯著高于其它CSF組(P＜0.001)，而GBM CSF組也顯著高于其它CSF組(P＜0.05或P＜0.01)。在10種被檢測的高豐度蛋白中，5種蛋白分別占CSF和CF中被檢測蛋白總含量的99％和98％以上。除了AGP外，GBM患者CF中9種蛋白的含量顯著性高于各組CSF(P＜0.05或P＜0.001)。而GBM CSF中ALB，I

9、gG，AAT，FIB，APOA1和TRF等6種蛋白的濃度顯著性高于其它CSF組。比較這些蛋白的相對含量后發(fā)現，CF中AAT，FIB，Cys-C和C3的相對含量較高，而在不同的CSF組間，GBM組CSF中IgG，AAT和TRF的相對含量較高，上述高豐度蛋白絕度和相對含量的改變，可能是蛋白質組總體Tm值變化的原因之一;在第二部分，根據預設的納入和排除標準，一共檢索到了8篇文獻，共計有19種蛋白被上述文獻驗證為存在于膠質瘤患者來源CSF中的差

10、異表達蛋白。根據GO注釋與PANTHER分析，絕大部分這些差異表達蛋白的分子功能是“結合”，亞細胞定位為“細胞外區(qū)域”;值得注意的是，它們參與的生物學過程為“炎癥反應”，“應激/缺氧應答”和“凋亡過程”等，提示它們可能參與了膠質瘤惡性進展和宿主抗腫瘤免疫應答等過程。根據HPA數據庫，絕大部分這些蛋白在膠質瘤組織中的表達量與正常CNS組織相比是升高的。在這19種蛋白中，只有一種蛋白被不同的文獻重復鑒定到，而這可能是由于不同研究在具體采用的

11、實驗方案上存在差異所造成。IPA分析顯示，這19種蛋白具有包括“炎癥反應”、“癌癥”、“細胞死亡和生存”在內的重要功能，參與了包括“急性期反應信號通路”、“VEGF信號通路”，“p38信號通路”等重要的通路，構建的第一個網絡圖的核心蛋白分子主要位于細胞核內，具有DNA結合，催化活性和轉錄調節(jié)活性等生物學功能，而第二個網絡圖顯示IL-6/STAT-3信號通路處于核心地位。據此，我們挑選了GAL，HSPA5，WNT和IL-6等4個節(jié)點蛋白，

12、在本課題收集的CSF與CF中進行了驗證，結果表明，GAL，HSPA5與WNT三個蛋白的含量在CF中顯著性低于CSF，但是在不同CSF組間不存在統(tǒng)計學差異;而IL-6不僅在GBM CF中的濃度顯著高于其他CSF組(P＜0.001)，而且在GBM CSF中的濃度顯著性高于其他惡性度較低膠質瘤組的CSF(P＜0.001)，提示IL-6具有成為GBM生物學標志物的潛力;在第三部分，我們在經過低豐度蛋白富集后的CSF中總共鑒定得到445種蛋白成分

13、。根據GO注釋，它們的細胞定位主要集中于細胞外(24％)、細胞膜(13％)、細胞質(11％)、其它細胞內的細胞器(11％)等，參與的生物學過程主要是調節(jié)(22％)、細胞過程(18％)、代謝過程(9％)、對刺激反應(9％)等，具有的分子功能主要是結合(48％)、催化活性(22％)、蛋白酶調節(jié)活性(10％)等。在這445種蛋白中，144種蛋白的表達與星形細胞瘤惡性程度相關，14種蛋白與膠質瘤瘤惡性程度相關，17種蛋白在高級別膠質瘤(HGG)

14、和LGG組間有顯著性差異表達，179種蛋白在原發(fā)和復發(fā)GBM組間有差異，135種蛋白在高級別少突膠質瘤和低級別少突膠質瘤之間有差異。IPA分析顯示，由這些差異蛋白構建的分子信號網絡中，涉及的Top Functions主要有蛋白合成，脂質代謝和小分子生化，碳水化合物代謝，細胞間信號傳導，免疫細胞遷移，體液性免疫應答，炎癥反應，DNA復制、重組和修復，癌癥，細胞運動，分子轉運，細胞死亡和生存，細胞周期等。通過ELISA驗證后，6種蛋白的含量

15、被證實在GBM組CSF中的含量顯著性高于其它惡性較低膠質瘤CSF組，它們分別是vinculin(VCL)蛋白、蛋白質二硫鍵異構酶A4、靜止素Q6巰基氧化酶1、肌肽二肽酶、血小板因子4和分泌型卷曲相關蛋白3。比較上述蛋白在GBM組織原代細胞培養(yǎng)上清和CSF中的含量后發(fā)現，SFRP3和VCL，尤其是后者在細胞上清中的含量顯著高于CSF，提示它們可能來源于腫瘤分泌。比較膠質瘤細胞系與非膠質瘤細胞系培養(yǎng)上清后發(fā)現，QSOX1、SFRP3和VCL

16、在膠質瘤細胞系上清中的含量較高，提示它們的分泌可能具有膠質瘤特異性，尤其是QSOX1，其濃度在H4、SW1783和U87這三種惡性度逐級上升的細胞系上清中也呈現逐級升高的趨勢，提示可能與膠質瘤惡性程度具有較好的相關性。上述蛋白在膠質瘤患者CSF和細胞上清中的差異表達，尚未見文獻報道。
　　結論:我們首次發(fā)現，基于CSF蛋白質組的熱穩(wěn)定性，快捷簡便的DSC檢測具有提示膠質瘤惡性程度的能力，而疾病狀態(tài)下多種高豐度蛋白質成分的改變可能是

17、Tm值改變的原因之一;由于DSC反映的是蛋白質組整體（特別是高豐度組分）的特征，因此利用高通量、高分辨率的蛋白質組質譜平臺檢測疾病狀態(tài)相關的低豐度蛋白的改變，不失為DSC技術的有力互補。我們進而首次對現有的膠質瘤CSF質譜研究進行了系統(tǒng)綜述，不僅總結了已報道的潛在生物學標志物，而且還驗證了通過生物信息學方法發(fā)現的新的標志物(如IL-6);我們最后還首次通過iTRAQ定量標記質譜技術對膠質瘤CSF蛋白質組進行了檢測，發(fā)現了CNDP1、PD

18、IA4、QSOX1、PF4、SFRP3和VCL等在GBM與其它惡性度較低膠質瘤之間存在差異表達的蛋白分子，而上述發(fā)現均未見文獻報道。這些膠質瘤相關的低豐度差異蛋白，其來源可能是腫瘤組織、腫瘤微環(huán)境或是機體反應性表達、分泌或釋放進入CSF，不僅有望成為GBM患者CSF中的生物學標志物，而且也值得進一步研究闡明其起到的生物學功能。當然，質譜技術也有著昂貴、耗時費力等不足，因此可以充分利用DSC技術快捷簡便的優(yōu)點予以互補，本課題因此也為今后對