miRNA激活p21WAF1-CIP1基因表達及其對膀胱癌細胞的抑制作用.pdf

1、第一部分miRNAs激活膀胱癌細胞p21WAF1/CIP1基因表達及其機制
　　目的：篩選能和抑癌基因p21WAF1/CIP1（p21）啟動子區(qū)域序列互補且評分較高的miRNAs，觀察miRNAs表達水平與臨床膀胱癌發(fā)生的相關(guān)性，檢測其對膀胱癌細胞系T24和EJ細胞p21是否有激活效應(yīng)，并初步探索其激活機制。
　　方法：采用miRanda算法檢索p21基因啟動子區(qū)域和miRBase數(shù)據(jù)庫里所有人miRNAs進行互補配對，尋找

2、評分較高的miRNA；應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測10對臨床膀胱癌組織和正常膀胱粘膜中這些miRNA和p21基因mRNA的表達水平；生物合成 dsControl，dsP21-322，miR-103b mimic，miR-370-5p mimic（miR-370 mimic），miR-1180-5p mimic（miR-1180 mimic）和miR-1236-3p mimic（miR-1236 mimic）（其中dsControl為陰性對

3、照，dsP21-322為陽性對照），通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（終濃度為50 nM），在膀胱癌細胞系T24和EJ細胞中過表達這些dsRNAs和miRNAs，72小時后采用實時熒光定量PCR和Western blot分別檢測p21 mRNA和蛋白表達水平；通過免疫熒光染色觀察p21蛋白亞細胞表達位置；采用亞細胞蛋白提取試劑盒抽提T24和EJ細胞蛋白，Western blot進一步檢測p21蛋白在胞漿和胞核表達水平。另外，合成3’或5’端標記生物素的

4、miRNAs以及反義鏈3’或5’端標記生物素的dsControl，進而轉(zhuǎn)染到T24和EJ細胞內(nèi)，72小時后采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）檢測生物素標記的dsRNA和miRNAs是否與p21啟動子相結(jié)合。
　　結(jié)果：通過miRanda算法檢索出miR-103b，miR-370，miR-1180和miR-1236分別與p21啟動子區(qū)域-907/-887，-552/-537，-397/-379以及-243/-226互補匹配評分較高

5、。實時熒光定量PCR提示相比正常膀胱粘膜細胞，miR-103b在膀胱癌中呈高表達，但差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；miR-370，miR-1180以及miR-1236在膀胱癌中低表達，與正常膀胱粘膜細胞相比，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。p21 mRNA在膀胱癌中也呈低表達，和正常膀胱粘膜細胞相比，其差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；行Pearson相關(guān)分析，miR-370，miR-1180和miR-1236表達

6、和p21 mRNA表達呈正相關(guān)，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；miR-103b表達與p21 mRNA表達呈負相關(guān)，無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染T24和EJ細胞72小時后，實時熒光定量 PCR和Western blot顯示與 Mock和dsControl相比，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236能顯著誘導(dǎo)p21 mRNA和蛋白表達，miR-103b未能誘導(dǎo)p21高表達。免疫熒光提示dsP21-322，miR-370，miR

7、-1180和miR-1236主要誘導(dǎo)T24和EJ細胞核p21高表達，亞細胞蛋白Western blot檢測進一步證實此現(xiàn)象。ChIP實驗證實轉(zhuǎn)染72小時后 miR-370，miR-1180和miR-1236主要通過與p21基因啟動子區(qū)域結(jié)合，從而激活p21表達。
　　結(jié)論：miR-370，miR-1180和miR-1236在人膀胱癌呈低表達，與p21 mRNA表達水平呈正相關(guān)；miR-370，miR-1180和miR-1236能通

8、過與p21基因啟動子直接結(jié)合而激活T24和EJ細胞的p21表達，并且主要激活胞核內(nèi)p21表達。
　　第二部分miRNA通過激活p21基因表達對膀胱癌細胞的抑制作用
　　目的：探討miR-370，miR-1180和miR-1236對膀胱癌T24和EJ細胞的增殖，周期，凋亡，衰老，集落形成，遷移和侵襲的影響。
　　方法：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染dsControl，dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimi

9、c和miR-1236 mimic到膀胱癌T24和EJ細胞。在轉(zhuǎn)染后72小時提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，利用普通PCR擴增細胞周期調(diào)節(jié)蛋白（Cyclin D1）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK4和CDK6）的cDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測Cyclin D1，CDK4和CDK6 mRNA的表達水平；流式細胞術(shù)檢測T24和EJ細胞周期分布和凋亡情況；β-半乳糖苷酶染色觀察T24和EJ細胞衰老情況；結(jié)晶紫染色觀察轉(zhuǎn)染后10天細胞集落形成情況；Cel

10、lTiter96○R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）檢測轉(zhuǎn)染后24小時，48小時，72小時，96小時和120小時等5個時間點細胞增殖情況；Transwell法檢測膀胱腫瘤細胞遷移和侵襲能力；共轉(zhuǎn)染特異性抑制p21的干擾RNA（siP21）和miR-1236，瓊脂糖凝膠電泳檢測p21 mRNA表達水平；并觀察共轉(zhuǎn)染siP21和miR-1236對細胞周期、集落形成和細胞增

11、殖的影響。
　　結(jié)果：在膀胱癌T24和EJ細胞中，與空白對照Mock和陰性對照dsControl轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic后72小時能顯著抑制CDK4，CDK6和Cyclin D1 mRNA的表達，誘導(dǎo)細胞周期循環(huán)G0/G1期停滯；進一步統(tǒng)計分析顯示，相比Mock和dsControl組，兩種細胞轉(zhuǎn)染dsP21-322，miR-370 m

12、imic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic后細胞G0/G1期比例升高，其差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；轉(zhuǎn)染72小時，dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic轉(zhuǎn)染組處于早期和晚期凋亡的細胞數(shù)明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；并且可以顯著的誘導(dǎo) T24和EJ細胞衰老；克隆增值實驗表明，相比 Mock和dsControl組，ds

13、P21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic轉(zhuǎn)染組細胞集落形成數(shù)量明顯減少，集落面積顯著變小，集落形成率顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；MTS檢測提示在轉(zhuǎn)染后第4天（96小時），較Mock和dsControl轉(zhuǎn)染組，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236能顯著抑制膀胱癌T24和EJ細胞增殖（P<0.05）；Transwell實驗證實

14、，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236較Mock和dsControl能顯著抑制T24和EJ細胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）；因在3個miRNA中，miR-1236在膀胱癌組織標本中表達水平最低的，故采用 miR-1236進行如下實驗。在 T24和EJ細胞分別共轉(zhuǎn)染miR-1236 mimic和siP21后能顯著抑制miR-1236誘導(dǎo)的p21 mRNA高表達；并且，siP21可有效消除miR-123

15、6對細胞周期循環(huán)、集落形成和細胞增殖的抑制作用。
　　結(jié)論：dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic轉(zhuǎn)染膀胱癌T24和EJ細胞可抑制Cyclin D1，CDK4和CDK6的表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞周期循環(huán)停滯于 G0/G1期，促進細胞凋亡和衰老，抑制腫瘤細胞集落形成和增殖。此外，miR-1236主要通過激活抑癌基因 p21的表達而誘導(dǎo)膀胱癌細胞周期循環(huán)G0/G1期停滯，抑