蜈蚣三七提取物抗類風濕性關節(jié)炎分子免疫機理的研究.pdf

1、類風濕性關節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)是最常見和致殘率最高的骨關節(jié)疾病之一，主要病理環(huán)節(jié)包括免疫功能失常，關節(jié)滑膜細胞聚積與滑膜增厚，關節(jié)軟骨和骨破壞三個方面。本實驗利用國際上研究RA通用的膠原性關節(jié)炎(CIA)小鼠模型，以中醫(yī)理論為指導，采用現(xiàn)代醫(yī)學先進的技術方法和實驗手段，從動物整體模型、關節(jié)組織、細胞和分子等不同層面進行系統(tǒng)、深入的研究，探討中藥蜈蚣三七提取物治療RA的免疫調節(jié)機理，為日后大規(guī)模應用于臨床提

2、供理論依據(jù)。 1蜈蚣三七提取物對CIA小鼠組織病理學及超微結構改變的影響 采用Ⅱ型膠原制作CIA小鼠模型，設立模型組、雷公藤組、蜈蚣三七提取物大、中、小劑量組、正常組及正常給蜈蚣三七提取物組，造模7d后開始灌胃給藥，于28d、36d分別處死1/2動物觀察各項指標。結果如下。 (1)取小鼠尾、趾關節(jié)用10％甲醛溶液固定、EDTA-Na2軟化，石蠟包理切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察。皮下軟組織充血或水腫情況：蜈蚣三

3、七提取物各劑量組、雷公藤組均能減輕關節(jié)軟組織充血、水腫程度，但以蜈蚣三七提取物小劑量組最為顯著?；こ溲[情況：蜈蚣三七提取物各劑量組、雷公藤組均能不同程度的減輕滑膜充血、水腫程度，但以蜈蚣三七提取物小劑量組最為顯著?；ぴ錾闆r：蜈蚣三七提取物各劑量組、雷公藤組均能不同程度的抑制滑膜增生，以蜈蚣三七提取物小劑量組最為顯著。滑膜炎性細胞浸潤情況：蜈蚣三七提取物各劑量組、雷公藤組均能減少局部炎性細胞的滲出，其中以蜈蚣三七提取物小劑量組最

4、為顯著。軟骨增生情況：蜈蚣三七提取物各劑量組和雷公藤組均有不同程度的抑制CIA小鼠趾、尾關節(jié)部軟骨細胞增生的作用，以小劑量組最為顯著。 (2)取小鼠尾、趾關節(jié)用戊二醛溶液固定、軟化作電鏡觀察。正常給藥組：正?；蛹毎詢饶び?-3層滑膜細胞組成，滑膜細胞疏松地平行排列，分為3型。A型細胞形似吞噬細胞，胞漿以線粒體為主，含小泡和溶酶體。B型細胞形似成纖維細胞，胞漿內富含粗面內質網(wǎng)，少量空泡和線粒體。AB型細胞，兼有兩種細胞的特點

5、。模型組：滑膜層細胞內膜明顯增厚，多達5～6層，滑膜細胞增生肥大，排列紊亂。細胞器變形，甚至消失，胞質內充滿大量空泡，胞核染色質分布不均。有的細胞因變性、壞死至萎縮，僅見到細胞碎塊與大量膠原纖維交錯排列。蜈蚣三七提取物小劑量組滑膜層細胞性內膜無增厚，細胞排列均勻。偶見少量淋巴細胞浸潤。A型細胞以初級溶酶體多見、線粒體稍增多。B型細胞的胞漿內富含粗面內質網(wǎng)及核糖小體。各型細胞接近正常。中劑量組滑膜層細胞性內膜增厚不明顯，細胞間質稍稀疏，少

6、量淋巴細胞浸潤。大劑量組滑膜層細胞性內膜增生明顯，大量炎性細胞浸潤，紅細胞滲到滑膜液中，超微結構基本正常。雷公藤組：滑膜層細胞性內膜增生，可見單核細胞淋巴細胞浸潤，胞漿內未見分泌顆粒，間或纖維細胞，線粒體豐富，胞核多有凹陷，各型細胞接近正常。 2蜈蚣三七提取物對CIA小鼠外周血及尾關節(jié)部相關CD分子及細胞因子的影響 取CIA小鼠外周血，采用流式細胞術(FCM)檢測CD4、CD2、CD28、CD80、CD86、CD30、C

7、D45、CD54、Fas(CD95)、CD106、CD137、CTLA-4(CD152)、CD154、CD25；取CIA小鼠血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-10、IL-4、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-6；取CIA小鼠尾關節(jié)切片，免疫組織化學技術(ICH)檢測Fas、Fas-L、IL-4、IL-10。結果蜈蚣三七提取物可提高CTLA-4、Fas、Fas-L、IL-4、IL-10IL-12、IFN-γ的表達水平，降

8、低IL-6、CD4、CD2及CD106的表達，對上述其他CD分子及細胞因子無明顯作用。 3蜈蚣三七提取物對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞CTLA-4、sFasmRNA及TLR-4表達的影響 分離小鼠脾淋巴細胞，ConA激發(fā)后，采用RT-PCR技術檢測CTLA-4、sFasmRNA；采用FCM檢測TLR-4。結果蜈蚣三七提取物可使ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞CTLA-4、sFasmRNA的表達水平趨于正常；TLR-4的表達未