Rab5a在卵巢癌細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一,死亡率一直高居?jì)D科腫瘤之首。卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素參與的極其復(fù)雜的過程。經(jīng)過多年的努力,人們雖然發(fā)現(xiàn)了一些癌基因、抑癌基因的異常與卵巢癌密切相關(guān),但對(duì)其發(fā)病的分子機(jī)制還未完全明了,因此發(fā)現(xiàn)新的卵巢癌相關(guān)基因及其作用機(jī)制對(duì)于完善卵巢癌的早期診斷和治療,以及改善患者的預(yù)后都具有十分重要的意義。
　　 本研究第一章證實(shí)了Rab5a在卵巢癌中高表達(dá)。本課題組前期研究表明Rabex5表達(dá)在卵巢

2、癌組織高于非癌變卵巢組織,而其下游效應(yīng)因子Rab5a的表達(dá)在卵巢癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(HO-8910PM)高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(HO-8910),因此我們推測Rab5a可能與卵巢癌有關(guān)。隨后我們從本院病理科獲取20例卵巢囊腫、20例卵巢腺瘤和39例卵巢癌石蠟包埋組織標(biāo)本,通過免疫組織化學(xué)分析Rab5a的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)該蛋白在卵巢癌中表達(dá)顯著高于卵巢囊腫和卵巢腺瘤,而且陽性細(xì)胞在囊腫和腺瘤組織中僅局限于上皮層,但在卵巢癌組織中,陽性細(xì)胞侵襲入間質(zhì),

3、呈散亂分布。所以Rab5a的檢測可能用于卵巢癌與非癌的鑒別診斷。本研究同時(shí)查詢了39例卵巢癌患者的病史資料,并根據(jù)他們的病理分級(jí)、臨床分期和腹腔轉(zhuǎn)移分別進(jìn)行分組,比較各組之間Rab5a表達(dá)的差異,結(jié)果顯示Rab5a的表達(dá)與卵巢癌的病理分級(jí)、臨床分期和轉(zhuǎn)移無關(guān)。
　　 由于Rab5a在表皮生長因子受體(EGFR)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用,因此我們推測Rab5a表達(dá)變化可能影響卵巢癌細(xì)胞的生長。本研究第二章通過PCR擴(kuò)增Rab5

4、a完整序列,分別插入pEGFP-N1(GFP)和pcDNA3.1(+)兩個(gè)真核表達(dá)載體,構(gòu)建了GFP-Rab5a、pcDNA-Rab5a重組體,分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株HO-8910,經(jīng)過G418篩選和流式細(xì)胞儀分選,建立了外源性Rab5a穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型。通過Western Blot分析發(fā)現(xiàn)GFP-Rab5a轉(zhuǎn)染細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)是內(nèi)源性Rab5a的3～5倍,pcDNA-Rab5a轉(zhuǎn)染細(xì)胞Rab5a的表達(dá)是對(duì)照細(xì)胞的4～6倍。同時(shí)本研

5、究還利用siRNA技術(shù)抑制HO-8910細(xì)胞中Rab5a的表達(dá),結(jié)果與對(duì)照細(xì)胞比較,Rab5a siRNA處理細(xì)胞中靶蛋白的表達(dá)量減少了90％以上,成功地建立了Rab5a表達(dá)抑制的細(xì)胞模型。通過MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-diphenytetrazo-liumromide]分析、CFDASE(Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl este

6、r)示蹤分析和細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),Rab5a表達(dá)增加能夠刺激卵巢癌細(xì)胞從G1進(jìn)入S期,促進(jìn)細(xì)胞的增殖。相反,Rab5a蛋白表達(dá)減少則抑制了卵巢癌細(xì)胞的生長。
　　 Rab5a在內(nèi)體的形成、移動(dòng)、黏附和融合中起重要作用,并通過這一過程影響EGFR的內(nèi)吞和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸,從而調(diào)節(jié)EGFR的信號(hào)傳導(dǎo)和代謝過程。Rab5a有許多下游效應(yīng)因子,如:EEA1(早期內(nèi)體自身抗原1)、PI3K(磷脂酰肌醇3磷酸)、Syntaxin-4、APPL1(A

7、daptor protein containing PH domain,PTB domain and Leucinezipper motif)等,其中APPL1直接把表皮生長因子(EGF)的細(xì)胞外刺激與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄相連接。因此我們推測在卵巢癌細(xì)胞中Rab5a可能與APPL1相互協(xié)作而調(diào)節(jié)EGFR的信號(hào)傳導(dǎo),并進(jìn)一步影響細(xì)胞的生長。本研究第三章利用RNA干擾技術(shù)抑制了HO-8910細(xì)胞中APPL1的表達(dá)。結(jié)果顯示當(dāng)APPL1表達(dá)被抑制后,HO

8、-8910細(xì)胞增殖也被抑制,表現(xiàn)為G1期生長部分停滯。而繼續(xù)抑制Rab5a的表達(dá),HO-8910細(xì)胞的生長停滯沒有進(jìn)一步增加,說明Rab5a可能通過APPL1來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長。隨后,本研究利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Rab5a與APPL1能夠在HO-8910胞漿中相互結(jié)合。血清饑餓過夜后,二者聚焦明顯減少,當(dāng)EGF刺激5min后,聚焦開始增加,15min達(dá)到峰值,然后二者逐漸分離。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),APPL1能夠進(jìn)入細(xì)胞核與MTA2(

9、metastasis associatedfamilyl,member2)相互作用,后者為NuRD(nucleosome remodelingand deacetylating)的組成部分,直接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
　　 總之,本研究結(jié)果顯示Rab5a在卵巢癌中表達(dá)顯著高于卵巢囊腫和卵巢腺瘤,而且陽性細(xì)胞在癌組織和非癌組織中分布明顯不同,因此該蛋白可能用于卵巢癌與非癌的鑒別診斷。通過建立細(xì)胞模型,本研究發(fā)現(xiàn)Rab5