穩(wěn)定表達(dá)人MCHR2基因CHO細(xì)胞系的建立及shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、肥胖是現(xiàn)代社會中常見的營養(yǎng)障礙性疾病，其發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家逐年上升，成為一個全球性的健康問題。肥胖不僅是導(dǎo)致心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、高脂血癥等疾病的高危因素，并且還帶來多個社會問題和心理問題。多年來研究發(fā)現(xiàn)肥胖的發(fā)生與下丘腦對攝食的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控密切相關(guān)；近年來繼神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y, NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白(agouti related protein,AgRP)、增食欲素(orexin,ORX)之后

2、，又一個與食欲相關(guān)的神經(jīng)肽—黑色素濃集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)進(jìn)入人們的視野，隨著研究的逐步深入相繼發(fā)現(xiàn)了MCH 的2個受體亞型-MCHR1(melanin-concentrating hormone receptor 1，MCHR1)和MCHR2(melanin-concentrating hormone receptor 2，MCHR2)。多個動物實驗證實MCH是一種能夠增加食欲的神

3、經(jīng)肽，在調(diào)節(jié)能量平衡中起重要作用。建立過度表達(dá)MCH的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠攝食過多，具有高脂蛋白血癥、高血糖、胰島素抵抗特點。敲除小鼠MCH基因，可導(dǎo)致消瘦綜合征(表現(xiàn)為小鼠攝食減少，代謝增加，體重減輕)，由此可見MCH在調(diào)節(jié)體重中起關(guān)鍵性作用。用基因敲除技術(shù)研究MCHR1的功能，發(fā)現(xiàn)MCHR1敲除小鼠體形瘦，脂肪含量低，進(jìn)食高脂飲食不易誘發(fā)肥胖；而MCHR1失活可減輕高脂飲食所誘導(dǎo)的肥胖?，F(xiàn)人們已研制出MCHR1的拮抗劑以期望治療肥胖

4、癥?？梢娔壳皩CH及MCHR1與肥胖和能量代謝的關(guān)系已明確，但MCHR2功能目前仍不清楚，國內(nèi)外未見其與肥胖關(guān)系的明確報道。 MCHR2基因定位于染色體6q16.2-6q21， cDNA全長1023 bp，編碼340個氨基酸的蛋白質(zhì)。通過定量RT-PCR、Northem雜交及原位雜交技術(shù)證實MGtR2主要在大腦表達(dá)，尤其在下丘腦前部和外側(cè)區(qū)以及腹內(nèi)側(cè)核區(qū)表達(dá)豐度高，而攝食調(diào)控中樞位于下丘腦，表明MCHR2可能參與進(jìn)食行為的調(diào)控。此外，

5、據(jù)報道肥胖患者在第6號染色體長臂發(fā)生細(xì)胞遺傳學(xué)改變，而MCHR2正好定位于染色體6q，也提示MCHR2可能與肥胖的發(fā)生相關(guān)。因此需要對MCHR2基因的功能做進(jìn)一步研究以明確其與肥胖的關(guān)系，從而為肥胖癥的防治提供新的靶點。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是通過雙鏈RNA介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程。它作為新興的基因阻斷技術(shù)，逐漸成為探索基因功能的新手段。本課題采用RNA干擾技術(shù)，以人MCHR2基

6、因為靶點，設(shè)計并合成shRNA真核表達(dá)載體，并研究其對細(xì)胞中MCHR2的表達(dá)及生物活性等特征的影響，為進(jìn)一步利用RNAi在動物整體水平研究MCHR2基因功能奠定良好的實驗基礎(chǔ)。本研究主要分以下三個部分： 1．穩(wěn)定表達(dá)人MCHR2基因CHO細(xì)胞系的建立。 方法：采用PCR方法，以人胎腦cDNA文庫為模板擴(kuò)增人MCHR2基因的全長cDNA編碼區(qū)序列，將其定向插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，經(jīng)酶切和測序鑒定后，用脂質(zhì)

7、體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，通過G418篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系，用RT-PCR、Western blotting及免疫熒光法檢測MCHR2的表達(dá)；利用放射性配體結(jié)合實驗(Radioligand binding assay，RBA)、鈣流檢測、環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)測定等鑒定MCHR2特征。 結(jié)果：成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)/MCHR2真核表達(dá)載體，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C

8、HO細(xì)胞系，成功地表達(dá)目的基因；RBA檢測其最大結(jié)合容量(B<,max>)為309.97±1.14 fmolL<'-1>·mg<'-1>protein，平衡解離常數(shù)(K<,d>值)為0.170±0.0006nmol/L；黑色素濃集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)能刺激Ca<'2+>釋放，其半數(shù)有效濃度(50％ effective concentration，EC<,50>)為2.32±0.01

9、nmol/L。 結(jié)論：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCHR2的CH0細(xì)胞系建立及其特征鑒定為進(jìn)一步研究MCHR2功能奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。 2．人MCHR2基因shRNA的設(shè)計及真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定。 方法：根據(jù)MCHR2基因序列，設(shè)計并合成特異性的小干擾片斷，并將其定向克隆到帶有卡那霉素抗性和增強(qiáng)綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pGenesil-1中，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析和DNA序列測定。 結(jié)果：通過酶切鑒定和序列測定，成

10、功構(gòu)建四條表達(dá)短發(fā)夾RNA的質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)粒。 結(jié)論：針對人MCHR2的shRNA真核表達(dá)載體成功構(gòu)建為進(jìn)一步利用RNAi研究MCHR2功能奠定了良好的基礎(chǔ)。 3．shRNA真核表達(dá)載體對人MCHR2基因表達(dá)及特征的影響。 方法：將shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)人MCHR2基因的CHO細(xì)胞中，通過RT-PCR測定細(xì)胞中MCHR2基因mRNA水平的表達(dá)；Westemblotting檢測MCHR2蛋白水平的

11、變化；放射性配體結(jié)合實驗(RBA)檢測受體最大結(jié)合容量(B<,max>)及平衡解離常數(shù)(K<,d>值)的變化；鈣流檢測實驗觀察配體(MCH)刺激后單個細(xì)胞Ca<'2+>釋放及MCH半數(shù)有效濃度(EC<,50>)的變化。 結(jié)果：shRNA真核表達(dá)載體能有效抑制CHO細(xì)胞中MCHR2基因的表達(dá)。與轉(zhuǎn)染pGenesil-1空載體組比較，使MCHR2基因mRNA表達(dá)減少45.8％～66.4％；蛋白表達(dá)減少44.2％～81.0％。RBA實

12、驗中pGenesil-1-MCHR2-shRNA使B<,max>減少，K<,d>值升高；與轉(zhuǎn)染pGenesil-1空載體組比較，B<,max>減少39.4％～78.7％，K<,d>值升高40.9％～81.9％。shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后MCH刺激單個細(xì)胞Ca<'2+>釋放的Ratio A減小，EC<,50>升高；與轉(zhuǎn)染pGenesil-1空載體組比較，EC<,50>升高114.8％～822.4％。 結(jié)論：MCHR2基因shRN