三維凝膠DNA芯片熱聚合制備及其應(yīng)用研究.pdf

1、基因芯片技術(shù)已成為近年來的研究熱點(diǎn)，其高通量的平行性分析的特點(diǎn)受到了越來越多的關(guān)注。同二維凝膠芯片相比，三維聚丙烯酰胺凝膠芯片具有固定DNA能力高的特點(diǎn)，它已被應(yīng)用于眾多的研究領(lǐng)域。但是，目前制備聚丙烯酰胺凝膠芯片的方法仍然存在較多缺點(diǎn)，如制備速度慢、芯片易污染以及信噪比較低等。本研究發(fā)展了一種制備聚丙烯酰胺凝膠芯片的新方法，提高了凝膠芯片的信噪比，建立了基于凝膠芯片的SNP檢測(cè)平臺(tái)。此外，還成功地發(fā)展了一種用于焦測(cè)序的單鏈DNA模板凝

2、膠制備技術(shù)，初步建立了芯片固相焦測(cè)序平臺(tái)。 1.熱介導(dǎo)法制備聚丙烯酰胺凝膠芯片。發(fā)展了凝膠芯片的熱聚合制備法。將不會(huì)凝集的預(yù)聚物(包含PCR產(chǎn)物，1.4％過硫酸銨，6％丙烯酰胺，20％甘油和平衡水)點(diǎn)樣到芯片上，通過直接對(duì)預(yù)聚物芯片80℃加熱2min，可以實(shí)現(xiàn)三維凝膠芯片的快速制備。本研究?jī)?yōu)化了PCR產(chǎn)物凝膠芯片的制備條件，提高了DNA的固定效率和芯片制備的質(zhì)量，研究了凝膠芯片上進(jìn)行單堿基或多堿基錯(cuò)配檢測(cè)的條件。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明

3、：與現(xiàn)有凝膠芯片制備方法相比，該方法具有制備簡(jiǎn)單、快速、無需激發(fā)劑四甲基乙二胺等優(yōu)點(diǎn)。此外，PCR產(chǎn)物可以直接被用于凝膠芯片制備中，從而節(jié)省大量PCR產(chǎn)物純化的時(shí)間和避免PCR產(chǎn)物可能的污染。 2.三維凝膠芯片在SNP分型上的應(yīng)用。應(yīng)用熱聚凝膠芯片，研究了γ-氨基丁酸A受體的β2基因(GABRB2)兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)(包括194072A/G位點(diǎn)和252944C/G位點(diǎn))的基因分型。首先，運(yùn)用等位基因特異探針雜交法對(duì)

4、凝膠芯片上54個(gè)靶標(biāo)DNA進(jìn)行了SNP分型檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：熱聚法凝膠芯片能夠準(zhǔn)確地對(duì)試驗(yàn)樣本進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果獲得了進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。還發(fā)展了熱聚凝膠芯片等位基因特異延伸技術(shù)，進(jìn)行SNP基因分型方法研究。但是，該方法中仍有一些引物-模板間的堿基錯(cuò)配如G：T、C：A等容易發(fā)生錯(cuò)配延伸現(xiàn)象，這樣容易造成了SNP檢測(cè)信號(hào)的假陽性問題。為解決這個(gè)問題，三磷酸腺苷雙磷酸降解酶(apyrase)介導(dǎo)的等位基因特異延伸反應(yīng)被應(yīng)用于SNP基因分型的檢

5、測(cè)。借助該降解酶能夠有效阻止或減慢錯(cuò)配的引物-模板之間的延伸反應(yīng)，提高了延伸法檢測(cè)SNP分型的特異性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多樣本的GABRB2基因194072A/G位點(diǎn)SNP的正確分型。該研究進(jìn)一步提高了熱聚凝膠芯片利用延伸法進(jìn)行SNP分型的準(zhǔn)確性，為熱聚凝膠芯片的SNP分型應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。熱聚凝膠芯片還具有較高的應(yīng)用潛力和拓展空間，如突變研究、甲基化檢測(cè)以及凝膠固相PCR等。 3.低頻超聲提高凝膠芯片信噪比。對(duì)于三維凝膠芯片來說，聚

6、丙烯酰胺凝膠是一種具有多孔結(jié)構(gòu)的DNA支持介質(zhì)。雖然該結(jié)構(gòu)提高了DNA固定能力，但是由于多孔結(jié)構(gòu)對(duì)雜交熒光探針具有強(qiáng)烈吸附作用，又會(huì)造成了凝膠芯片較高的背景噪音。本研究采用了低頻超聲快速清除非鍵合探針的技術(shù)，很好地降低了凝膠芯片背景，提高了凝膠芯片的信噪比。實(shí)驗(yàn)中對(duì)超聲條件和雜交探針特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)適合超聲法處理凝膠芯片的報(bào)告探針適合長(zhǎng)度為13堿基，超聲的較好條件是15℃處理35sec。上述條件下，凝膠芯片的信噪比能獲得了很大提高。

7、最后，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)具有114個(gè)樣本的凝膠芯片進(jìn)行了處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低頻超聲的方法能夠有效提高凝膠芯片的信噪比，滿足多樣本凝膠芯片進(jìn)行基因分型高靈敏度的要求。該技術(shù)為三維凝膠芯片提高信噪比提供了一種高效、快速的新方法。 4.三維凝膠芯片在焦測(cè)序中的應(yīng)用。焦測(cè)序是一種新的重要的測(cè)序方法。高質(zhì)量低成本的測(cè)序模板制備是獲得準(zhǔn)確測(cè)序信號(hào)的保證。目前制備焦測(cè)序單鏈DNA模板的方法有酶消化法和磁珠或瓊脂糖珠子法。酶消化法需要對(duì)PCR產(chǎn)物中

8、的所有干擾因素，如過剩擴(kuò)增引物、dNTP和焦磷酸等進(jìn)行完全消化以消除對(duì)測(cè)序信號(hào)的干擾，該方法成本較高且很難獲得理想的單鏈DNA測(cè)序模板。磁珠或瓊脂糖珠子法雖然能夠獲得的模板量較大，但成本仍高且需要特殊的裝置。為此，本研究借助熱聚凝膠法為焦測(cè)序制備了凝膠固定的DNA測(cè)序模板。試驗(yàn)過程中，將PCR產(chǎn)物直接混合到凝膠預(yù)聚物中，通過對(duì)其加熱聚合后，再將凝膠固定的雙鏈DNA變性，即可得到焦測(cè)序單鏈DNA模板。試驗(yàn)結(jié)果表明液相焦測(cè)序中能夠獲得高質(zhì)量