Akt信號(hào)通路在膀胱腫瘤的進(jìn)展及化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究首先探討了Akt信號(hào)通路中多個(gè)效應(yīng)因子的表達(dá)水平與膀胱癌的進(jìn)展之間的關(guān)系，然后通過(guò)Akt靶向抑制劑MK2206對(duì)膀胱癌細(xì)胞作用后，研究MK2206在提高順鉑(CDDP)誘導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性及凋亡中的作用，進(jìn)而為探索新的增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的分子指標(biāo)及可能的加速殺傷腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制，改善傳統(tǒng)的化療方案提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　(1)培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞并通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)各種細(xì)胞株中Akt及Akt信號(hào)通路中

2、下游分子的表達(dá)水平，包括RT112，RT4，253J，J82，T24，UMUC3等。
　　(2)采用細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)（四甲基偶氮唑藍(lán)法，MTT）法檢測(cè)MK2206和CDDP各自對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用，計(jì)算CDDP的半數(shù)抑制濃度(50％ inhibitingconcentration，IC50)，并然后通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)各膀胱癌細(xì)胞在MK2206和CDDP各自作用后的磷酸化Akt及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;通過(guò)MTT檢測(cè)MK2206+C

3、DDP的聯(lián)合治療對(duì)各膀胱癌細(xì)胞(RT112，253J，UMUC3，T24)的生長(zhǎng)抑制作用，并通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)聯(lián)合治療后的T24及RT112中Akt信號(hào)通路中各分子指標(biāo)的表達(dá)水平及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，探討聯(lián)合治療中MK2206增加CDDP誘導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性及凋亡的分子通路機(jī)制。
　　(3)采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MK2206抑制浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞株UMUC3的侵襲能力，并通過(guò)免疫印跡方法檢測(cè)與侵襲有關(guān)的上皮間充

4、質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中各指標(biāo)snail，slug及ZEB1的表達(dá)水平變化，探討MK2206抑制細(xì)胞侵襲能力的作用機(jī)制。
　　(4)采用膀胱癌細(xì)胞株RT112建立膀胱癌動(dòng)物模型（小鼠皮下腫瘤模型），研究各種藥物的體內(nèi)治療腫瘤的效果;采用腹腔注射的方法將藥物注射到小鼠體內(nèi)并分組，對(duì)照組(DMSO)、CDDP組、MK2206組、MK2206+CDDP組，觀(guān)察各組中對(duì)膀胱癌皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響情況，并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)四組動(dòng)物模型中

5、的皮下腫瘤標(biāo)本的Ki-67表達(dá)，分析各組藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制情況。
　　結(jié)果：
　　(1)蛋白免疫印跡檢測(cè)在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞株中(253J，J82，T24，UMUC3)磷酸化Akt及下游的效應(yīng)分子表達(dá)增強(qiáng)，而在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞株中(RT112，RT4)磷酸化Akt及下游的效應(yīng)分子無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)。
　　(2) MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MK2206(500nM)聯(lián)合CDDP可以提高CDDP誘導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性作

6、用，從而增加膀胱癌腫瘤細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性。蛋白免疫印跡檢測(cè)到聯(lián)合CDDP治療，MK2206(500nM)可以增強(qiáng)CDDP引導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)，而這種凋亡效應(yīng)依賴(lài)于磷酸化Akt及其下游效應(yīng)分子表達(dá)水平的抑制。
　　(3) MK2206(500nM)抑制磷酸化Akt及下游效應(yīng)分子表達(dá)水平，還可以抑制UMUC3的侵襲能力，并且抑制侵襲相關(guān)蛋白snail，slug及ZEB1的表達(dá)水平，這些指標(biāo)也與化療敏感性密切相關(guān)。
　　(4

7、)體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合治療組(MK2206+CDDP)能抑制皮下腫瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì)，而且能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)論：
　　(1)磷酸化Akt及下游效應(yīng)分子的表達(dá)增強(qiáng)與膀胱癌的進(jìn)展密切相關(guān)。
　　(2)Akt靶向抑制劑MK2206可以抑制肌層浸潤(rùn)性膀胱癌細(xì)胞株的侵襲能力，抑制細(xì)胞的侵襲能力與侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平的降低有緊密關(guān)系。
　　(3)Akt靶向抑制劑MK2206聯(lián)合CDDP可以通過(guò)抑制Akt表達(dá)及A