轉(zhuǎn)導人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因致人骨髓間充質(zhì)干細胞永生化的研究.pdf

1、目的: 人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs）可被誘導分化為多種細胞，被認為是組織工程種子細胞的重要來源。在體外培養(yǎng)時，hBMSCs壽命有限，隨傳代次數(shù)增加其分化能力逐漸喪失，這限制了其在組織工程中的研究和運用。轉(zhuǎn)基因技術迅速發(fā)展，使永生化細胞建立成為可能。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因轉(zhuǎn)入人骨髓間充質(zhì)干細胞中，以建立永生化的入骨髓間充質(zhì)干細胞。 方法: 通過脂質(zhì)體將含有hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載

2、體（pLEGFP-C1-hTERT）轉(zhuǎn)入包裝細胞PT67，G418篩選出表達病毒的陽性細胞克隆。選取3個細胞克隆，各自進行擴增培養(yǎng)。通過NIH 3T3對選取細胞的上清進行病毒滴度測定，確定最高病毒滴度。提取并擴增hBMSCs，用病毒滴度最高的上清感染第三代（P3）hBMSCs。G418篩選感染后的細胞，選取3個單克隆分別進行擴增培養(yǎng)。通過RT-PCR和Western Blot測定hTERT基因是否轉(zhuǎn)入hBMSCs中并表達。對P3轉(zhuǎn)導后的

3、hBMSCs （hTERT-hBMSCs）在形態(tài)學，細胞表型，向軟骨細胞誘導方面研究證明hTERT-hBMSCs仍保持轉(zhuǎn)導前的特性。通過MTT法測繪轉(zhuǎn)導前后hBMSCs生長曲線，觀察hTERT基因轉(zhuǎn)入后對細胞增殖的影響。通過TRAP-ELISA對hTERT-hBMSCs中端粒酶活性進行檢測；通過平板克隆形成實驗和裸鼠致瘤實驗對hTERT-hBMSCs致瘤性方面進行研究。 結果: 通過RT-PCR和Western Blot檢測，轉(zhuǎn)

4、導后hBMSC中有hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表達，而未轉(zhuǎn)導hBMSC中雖可測到hTERT基因弱的mRNA轉(zhuǎn)錄，但是沒有測到蛋白的翻譯。hTERT-hBMSCs在形態(tài)學上和hBMSC一樣呈長梭形，但是由于轉(zhuǎn)導有EGFP基因，前者有綠色熒光蛋白表達。通過流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)導前后hBMSC表面抗原標記：CD29，CD71，CD106，CD45和CD34，結果為前三項抗原都是陽性，后兩項為陰性。在功能學方面，通過向軟骨細胞誘導，免疫細胞

5、化學檢測到轉(zhuǎn)導前后的細胞都呈棕黃色，說明有軟骨細胞特異性標記Ⅱ型膠原蛋白表達。TRAP-ELISA檢測到hTERT-hBMSCs中端粒酶活性，而沒有測到未轉(zhuǎn)導hBMSC中端粒酶活性。hTERT-hBMSCs增殖能力增加，現(xiàn)其傳代數(shù)在50代以上。在體外平板克隆培養(yǎng)中，hTERT-hBMSCs和hBMSCs細胞克隆形成不僅數(shù)量少，而且細胞生長狀態(tài)差，克隆形成率為0.83%和0.67%，低于正常細胞克隆形成率1%，而對照組惡性黑色素瘤細胞克隆

6、數(shù)量多，細胞生長狀態(tài)好，克隆形成率為57.4%，遠遠高于腫瘤細胞克隆形成率10%。在裸鼠致瘤實驗中，陽性對照惡性黑色素瘤細胞接種于裸鼠背部皮下，三周后局部就形成的腫塊，HE染色為惡性黑色素瘤細胞，而注射有hTERT-hBMSCs的部位觀察兩月未見腫物形成，局部皮下組織HE染色為皮下疏松結締組織。 結論: hTERT基因成功導入hBMSCs后不改變hBMSCs細胞形態(tài)，表面標記和分化功能，保持其向軟骨細胞分化的能力。hTERT基因