miR-146a在胃癌中的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、目的:
　　研究microRNA-146a(miR-146a)在胃癌中的作用，并探討與其作用相關(guān)的靶基因。
　　方法:
　　qRT-PCR檢測60例胃癌組織和對應(yīng)癌旁組織miR-146a的表達，分析其表達水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;同時，qRT-PCR檢測人胃癌細胞株MKN-45、SGC-7901、MGC-803和HGC-27 miR-146a的表達情況。運用慢病毒顆粒過表達MKN-45和SGC-7901細胞中miR-

2、146a水平，干擾MGC-803和HGC-27細胞中miR-146a的表達。CCK-8法和平板克隆形成實驗觀察miR-146a對胃癌細胞株增殖的影響;劃痕愈合實驗和鋪或不鋪Matrigel的transwell小室實驗檢測miR-146a對胃癌細胞株遷移、侵襲能力的作用;裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型體內(nèi)實驗進一步驗證miR-146a對胃癌轉(zhuǎn)移能力的作用;利用靶基因預測軟件并結(jié)合雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)探討miR-146a與轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因;qRT-

3、PCR法和Western blot法檢測miR-146a作用于靶基因的機制;在過表達miR-146a的胃癌細胞株基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染不含3'UTR的WASF2（上述驗證的miR-146a與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因）編碼區(qū)，在miR-146a inhibitor處理的胃癌細胞株基礎(chǔ)上干擾WASF2，探討miR-146a對胃癌的作用是否通過靶基因WASF2介導;免疫組化法檢測60例胃癌組織和對應(yīng)癌旁組織WASF2的表達，分析其表達水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)

4、性;分析60例胃癌組織中miR-146a與WASF2水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.miR-146a在胃癌組織中表達下降。在本實驗的60例胃癌及相應(yīng)癌旁組織中，miR-146a的相對中位表達水平分別為0.162±0.019和0.823±0.072，P＜0.01，差異具有明顯統(tǒng)計學意義。
　　2.miR-146a在胃癌中的表達水平與腫瘤的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-146a表達越低，胃癌患者的TNM分期越晚，

5、P=0.018; miR-146a表達越高，胃癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率越低，P＜0.001。
　　3.miR-146a在胃癌細胞系MKN-45和SGC-7901中表達較低，在MGC-803和HGC-27細胞中表達較高，過表達MKN-45和SGC-7901細胞中miR-146a水平，干擾MGC-803和HGC-27細胞中miR-146a的表達，用于后續(xù)的細胞生物學行為研究。
　　4.CCK-8法檢測細胞OD值結(jié)果顯示:過表達

6、和干擾miR-146a對胃癌細胞生長曲線無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義;平板克隆形成實驗結(jié)果顯示:過表達和干擾miR-146a胃癌細胞克隆形成率無明顯差異，miR-146a對胃癌細胞群體依賴性和增殖能力無影響。
　　5.劃痕愈合實驗顯示miR-146a可降低胃癌細胞的遷移能力，轉(zhuǎn)染miR-146a的MKN-45和SGC-7901細胞24h后劃痕仍有相當?shù)木嚯x，而對照組劃痕有明顯的變窄。不鋪matrigel的tranwell小室實驗結(jié)

7、果顯示，MKN-45和SGC-7901細胞miR-146a過表達組24h后Transwell小室每視野細胞數(shù)較對照組明顯減少，P值分別為P=0.0037和P＜0.0001;MGC-803和HGC-27細胞miR-146a干擾組24h后Transwell小室每視野細胞數(shù)較對照組明顯增多，P值分別為P＜0.0001和P=0.0039。進一步提示miR-146a可抑制胃癌細胞遷移能力。
　　6.鋪matrigel的tranwell小室實

8、驗結(jié)果表明，miR-146a可降低胃癌細胞的侵襲能力。MKN-45和SGC-7901細胞miR-146a過表達組24h后Transwell小室每視野細胞數(shù)較對照組明顯減少，P值分別為P=0.0007和P＜0.0001;MGC-803和HGC-27細胞miR-146a干擾組24h后Transwell小室每視野細胞數(shù)較對照組明顯增多，P值分別為P=0.0045和P=0.0015。
　　7.裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下mi

9、R-146a過表達組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少，全肺間斷抽樣切片20張每張切片平均肺轉(zhuǎn)移病灶miR-146a過表達組和對照組分別為8±2 vs20±3，P=0.0182。
　　8.靶基因預測軟件結(jié)合雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)結(jié)果驗證了WASF2是miR-146a腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因，miR-146a降低WASF23'UTR克隆載體psiCHECK2相對熒光值達45％。
　　9.qRT-PCR和Western blot檢測miR-146

10、a過表達和干擾胃癌細胞株WASF2mRNA和蛋白水平結(jié)果表明，miR-146a作用于靶基因WASF2的機制是抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯。
　　10.回補實驗結(jié)果顯示，過表達WASF2可逆轉(zhuǎn)miR-146a對MKN-45細胞遷移侵襲能力的抑制作用;反之，干擾WASF2表達可逆轉(zhuǎn)miR-146a inhibitor促MKN-45細胞遷移侵襲能力。
　　11.免疫組化檢測60例胃癌及相應(yīng)癌旁組織WASF2水平表明，WASF2在胃癌組織中高表

11、達，癌組織和癌旁組織表達差異具統(tǒng)計學意義，P＜0.001;且胃癌組織WASF2的表達水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，WASF2表達越高，胃癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率越高，P=0.013。
　　12.分析胃癌組織中miR-146a與WASF2水平相關(guān)性結(jié)果顯示，WASF2低表達組miR-146a中位水平為0.227±0.035;WASF2高表達組miR-146a中位水平為0.118±0.017，胃癌組織中miR-146a表達水平與WA