微絲相關(guān)蛋白hHBrk1在腫瘤組織中的表達及其與肌球蛋白Ⅵ相互作用的初步研究.pdf

1、人同源BrckI基因(hHBrkl)是本實驗室應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)從人支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化細胞系BERP35中克隆到的差異表達基因。由于與玉米的Brickl有高度同源性，因此命名為hHBrkl。hHBrkl在動植物界高度保守，編碼一種微絲相關(guān)蛋白，參與微絲的聚合。hHBrkl基因(GenBank：AYl48219)，又名HSPC300、C30RF10及MDS027，位于3號染色體短臂25.3-24.1區(qū)，與抑癌基因VHL鄰近，由3個外顯

2、子和2個內(nèi)含子構(gòu)成，編碼75個氨基酸殘基，分子量約9 Kd。hHBrkl能與Rho GTP酶的效應(yīng)分子WAVEl的SHD區(qū)相互作用，參與微絲成核作用，調(diào)節(jié)細胞運動。hHBrkl蛋白家族在第47～67位氨基酸殘基存在一個七重復(fù)(Heptaedrepeat,HR)結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域可形成特殊的卷曲螺旋，是介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的重要結(jié)構(gòu)。前期的研究表明hHBrkl可能通過促進微絲的異常聚合參與腫瘤的遷移。 本研究的第一階段首先利用組織譜

3、陣列芯片技術(shù)構(gòu)建了hHBrkl在多腫瘤及癌旁正常組織差異表達譜。篩選出了hHBrkl基因表達上調(diào)的肺癌組織和表達下調(diào)的腎癌組織。接著，通過半定量RT-PCR技術(shù)對8對16例肺癌及癌旁正常組織的hHBrkl基因表達差異進行檢測，驗證了hHBrkl在肺癌與癌旁正常組織中的差異表達。第二階段，以實驗室前期構(gòu)建的pGEX4T-hHBrkl為基礎(chǔ)，原核表達了融合蛋白GST-hHBrkl，運用GST-pulldown實驗結(jié)合蛋白質(zhì)肽指紋質(zhì)譜分析技術(shù)

4、得到了hHBrkl相互作用蛋白質(zhì)肌球蛋白Ⅵ。肌球蛋白Ⅵ屬于肌球蛋白超家族成員，Yoshida發(fā)現(xiàn)肌球蛋白Ⅵ基因高表達的卵巢癌細胞容易向腹腔播散；而微絲聚合促進因子WAVE2則與黑色素瘤的浸潤表型有關(guān)，該結(jié)果提示hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ相互作用形成復(fù)合物可能與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制密切相關(guān)。為了進一步驗證實驗結(jié)果的可靠性，我們構(gòu)建了hHBrkl原核表達載體pGBTNH-hHBrkl并獲得了融合蛋白His-hHBrkl在大腸桿菌中高效表達

5、。并以此為基礎(chǔ)，在95D細胞的裂解液中完成了hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ的免疫共沉淀，驗證了hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ的相互作用。運用激光共聚焦技術(shù)，觀察到了hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ共定位于95D細胞的胞漿。第三階段，分別構(gòu)建了hHBrkl的突變?nèi)笔w和肌球蛋白Ⅵ的各功能區(qū)截短體，在原核和真核獲得了融合蛋白的表達，通過免疫共沉淀技術(shù)鑒定了hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ的作用位點位于肌球蛋白Ⅵ的卷曲螺旋區(qū)(Coiled-coil)、球狀區(qū)(Globu